1 材料与方法

1。1实验材料

实验所采用的乡城原矛头蝮蛇毒、菜花原矛头蝮蛇毒和原矛头蝮蛇毒均为实验室自备品，商用抗蝮蛇毒血清是来源于上海赛伦生物有限公司。免疫注射用大白兔两只，单笼饲养于同一25 ℃人工气候室内。饲养期间按时供水供食，并在食物中添加适量维生素和钙质。实验动物免疫期间，每天按时检查兔子的行为反应与进食状态是否异常。

1。2实验方法

1。2。1 实验室自制抗蛇毒血清

1。2。1。1类毒素抗原制备及兔子免疫

从‒80 ℃超低温冰箱内取出实验用三种蛇毒，将其恢复至室温后称取实验使用量。随后将三种蛇毒分别溶于生理盐水中，使溶液的最终浓度达到10 mg/ml。将三种蛇毒溶液等体积混合后，置于60 ℃恒温水浴锅内孵育30 min减毒以制备类毒素，随后保存于‒20 ℃冰箱备用。将得到的类毒素与弗式完全佐剂（Sigma-Aldrich）混合乳化，以0。2 mg/kg的剂量经兔背部皮下及腋下多位点进行首程注射免疫，此后三次注射加强剂量依次为0。4、0。8和0。8 mg/kg[9-10]。用蛇毒类毒素免疫兔子可诱导机体产生相应的抗体，且连续对兔子进行加强免疫，可使抗体的诱导量保持稳定水平[11]。

1。2。1。2抗蛇毒血清的采集

首程免疫2 d前及第三次加强免疫结束两周后，通过兔耳静脉少量采血，置于1。5 ml离心管内，待凝固后置于4 ℃冰箱静置24 h。静置后10000 rpm，4 ℃离心，收集上清液置于65 ℃水浴锅内孵育30 min减毒，随后‒20 ℃保存备用。以首程免疫血液样品为阴性对照，用ELISA检测免疫结束后实验动物血清的效价。待检测结果呈强阳性后，用心脏穿刺取血法采集免疫用大白兔全血，并用上述血清制备法获取免疫动物的抗蛇毒血清，并将所有血清在进一步分析前于‒20 ℃保存。

1。2。2免疫球的蛋白的分离纯化

从4℃冰箱内拿出柱子，将柱内的硫柳汞流出，并用binding buffer填充注射器，去掉塞让柱子与注射器相连接，防止空气进入柱子。用10倍柱体积的Binging Buffer 1ml/min洗脱柱子。将自制抗血清注入柱内（1 ml/min）；再用5-10倍柱体积的binding buffer 1 ml/min洗脱柱子，直至没有物料出现在废水中。收集管内加入1M Tris-HCl 60-200 μl，用2-5倍体积的elution buffer将样品洗脱至收集管内，再用3倍柱体积的PBS洗脱至收集管，最后用1M Tris-HCl调pH，每毫升待收集部分pH值为9。商用抗血清操作过程同上。

1。2。3抗体亲和层析柱的制备

分别用1 ml NHS活化的琼脂糖颗粒填装3ml针筒式层析柱管，制备商用抗血清层析柱及自制抗血清层析柱。用10-15倍柱体积的1 mM冰HCl洗涤柱子，然后再用2倍柱体积的结合缓冲液（0。2 M NaHCO3，0。5 M NaCl，pH 8。3）洗涤平衡柱子。将0。5 ml结合缓冲液（含50 mg自制抗蛇毒血清IgG）添加至上述层析柱，并置于摇床室温孵育4 h结合。将未结合组分流出并收集，用3 ml结合缓冲液冲洗平衡层析柱。随后加入1 ml pH8。0的封闭液，在室温下摇床摇动封闭4 h。3 ml封闭液洗脱柱子，将可能存在的未结合组分与第四步合并，测总未结合组分IgG浓度。将柱子分别用3倍柱体积的0。1 M Tris-HCl，pH8。5和含0。5 M NaCl的0。1 M 醋酸缓冲液pH4。0 交替洗脱至少6次，先酸后碱冲洗，再用3倍柱体积的洗脱缓冲液（20 mM PBS）平衡层析柱；文献综述

1。2。4蛇毒的亲和吸附、冻干

称取两份500 μg菜花原矛头蝮蛇毒，将其分开溶于0。5 ml PBS中，分别装载于商用抗血清和自制抗血清亲和柱内，4℃摇床孵育过夜。毒液与抗蛇毒血清比例约对应于每25 kDa毒素分子含有40个抗原位点。用PBS洗脱和收集柱内非吸附组分；用3倍柱体积的0。1 M Gly-HCl，pH2。0洗脱吸附组分，并立即用1 M Tris-HCl，pH9调至中性。亲和层析柱用PBS循环冲洗平衡柱子。将吸附和未吸附组分分别合并之后至冷冻干燥机或离心浓缩仪浓缩或冻干，也可置于浓缩仪浓缩至小体积，再于冻干机冻干。