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    摘要：细菌小 RNA（sRNAs）在细菌的基因表达调控过程中发挥着重要作用，可作为细菌毒力调控的关键调控调控因子。它能够通过碱基互补配对识别和结合靶位 mRNA，从而影响靶位 mRNA的转录、翻译或稳定性。本课题组前期研究表明：猪链球菌 sRNA rss06 与猪链球菌的毒力有关；结合转录组、蛋白组以及生物信息学，推测 SSU0057、SSU0097、SSU0591 这三个基因可能是 rss06 的靶位基因。本课题通过 pSET4s 质粒分别构建这三个基因与 Flag 标签融合表达载体 pSET4s-SSU0057、pSET4s-SSU0097、pSET4s-SSU0591，并通过同源同组技术分别将这三个表达质粒整合到猪链球菌野生株P1/7及其 rss06缺失株基因组中，并通过免疫转印技术，证实 SSU0057是 rss06的靶位。研究结果为进一步揭示rss06调控靶位与毒力机制提供参考。37980
    关键词：猪链球菌；小RNA；靶位基因
    Identifying the Targets of Streptococcus suis Small RNA rss06
    Abstract： Bacterial small non-coding RNAs (sRNAs) are recognized as key regulators in gene expression. It isalso considered as essential regulators in bacterial virulence. sRNAs can regulate targets by complementarybase-paring, thus affecting transcription, stability, or translation process of target mRNAs. The previousresearch demonstrated that sRNA rss06 contributes to Streptococcus suis virulence and the three genesSSU0057, SSU0097, and SSU0591 may be the rss06 targets by transcriptome, proteome, and bioinformaticsanalyses. In this study, these genes fused with Flag-tag were inserted into plasmid pSET4s, respectively; Therecombinant plasmids pSET4s-SSU0057, pSET4s-SSU0097, and pSET4s-SSU0591 were inserted into thechromosome of S. suis strain P1/7 and its rss06 mutant, respectively; Western Blot analysis showed thatSSU0057 is the direct target of rss06. These findings are helpful to further understand the regulationmechanisms of rss06 in targets and the virulence.
    Key words: Streptococcus suis；sRNA；target gene
    目录
    摘要1
    关键词1
    Abstract1
    Key words1
    引言 1
    1 材料与方法2
    1.1 材料2
    1.1.1 菌株、质粒和培养条件2
    1.1.2 主要试剂和仪器 2
    1.2 方法 2
    1.2.1 引物设计3
    1.2.2 扩增目的片段与融合 PCR4
    1.2.3 重组质粒的构建4
    1.2.4 化学转化重组质粒4
    1.2.5 重组质粒鉴定4
    1.2.6 猪链球菌感受态细胞的制备5
    1.2.7 电转重组质粒至猪链球菌感受态细胞5
    1.2.8 含重组质粒猪链球菌的筛选与鉴定5
    1.2.9 融合片段同源重组至猪链球菌基因组5
    1.2.10 Western Blot 测定靶位基因融合蛋白表达量5
    2 结果与分析6
    2.1 构建重组质粒6
    2.1.1 构建融合基因片段6
    2.1.2 鉴定重组质粒6
    2.2 含重组质粒猪链球菌的筛选和鉴定7
    2.3 Western blot 验证候选靶位基因表达8
    3 讨论11
    致谢10
    参考文献10
    猪链球菌（Streptococcus suis）是猪的重要致病菌，根据荚膜多糖抗原的不同，目前分为33 个血清型和较多未定型菌株。其中，猪链球菌2 型（SS2）致病力最强，流行最广，临床上主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎等，甚至可以导致急性死亡[1,2]。我国曾在 1998 年和 2005 年，两次爆发 2 型猪链球菌感染人的公共卫生事件，导致生猪从业人员死亡。在香港和越南，猪链球菌是引起人细菌性脑膜炎的主要病原[3,4]。猪链球菌可精细调控毒力基因表达。传统的转录调控因子主要为蛋白质类。目前至少有16 种转录调控因子参与调控基因的表达，影响猪链球菌在宿主体内增殖感染[5]。如转录因子CiaR-CiaH，参与调控黏附相关蛋白[6]；毒力负调控因子CovR 负调控荚膜合成相关基因、表面蛋白、溶血素的表达[7]。此外，猪链球菌小RNA（sRNAs）也参与对毒力的调控 [8]。细菌 sRNA 大多数长度小于 500nt，在细菌基因组中转录但不翻译[8,9]。sRNAs 通常位于基因间隔区，与位于其他位置的靶位 mRNA通过碱基配对有限互补结合。结合靶位可位于核糖体结合位点（RBS）附近或远离 RBS，直接或间接影响核糖体与 mRNA的结合从而影响翻译，或者影响mRNA的稳定性[10,11,12]。本课题组前期研究发现猪链球菌29个位于基因间隔区的 sRNAs， 其中sRNA rss06 等5个 sRNAs缺失株对斑马鱼毒力显著降低， 说明这 5 个 sRNAs与猪链球菌的毒力有关。 rss06在猪血液中上调表达，与野生株相比，rss06 缺失株在猪血中存活能力显著降低，但 rss06的直接靶位及调控毒力的机制未知。鉴定 sRNAs靶位通常需要结合转录组、蛋白组，以及生物信息学预测等方法[13]。指导教师前期工作采用 MS2 识别序列标签结合 RNA-Seq 的方法，筛选出 SSU0057 和 SSU0591两个可能的靶位基因。同时，采用 CopraRNA 生物信息学软件进行分析，预测 SSU0097也可能是 rss06 的直接靶位[14]。本课题通过 pSET4s 质粒分别构建这三个基因与 Flag 标签融合表达载体pSET4s-SSU0057、pSET4s-SSU0097、pSET4s-SSU0591，并通过同源同组技术分别将这三个表达质粒整合到猪链球菌野生株P1/7及其 rss06 缺失株基因组中，并通过免疫转印技术，验证rss06的直接靶位，为进一步揭示 rss06 调控靶位与毒力机制提供参考。
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