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摘要：水解腈的酶类（腈水解酶或腈水合酶/酰胺酶）被广泛应用于制药行业中生产有机羧酸及其衍生物，为了扩大腈水解酶的酶源，建立一种简单、快速且适用范围广的测定酶活性的方法是十分必要的。本论文利用盐酸羟胺和N,N'-二环己基碳二亚胺与被腈水解酶催化腈类得到的羧酸溶液反应生成羟肟酸，羟肟酸在氯化铁溶液中生成紫红色羟肟酸铁络合物显色的性质，通过紫外-可见分光光度法测量溶液吸光度来判断羧酸浓度。本研究对显色剂的浓度、显色反应的温度、反应时间对吸光度的影响进行优化，再对试验的抗干扰性进行测定，并将此法的准确度与高效液相色谱法进行对较。结果表明，显色反应的最佳条件为：DCC浓度为0.2mol/L，盐酸羟胺浓度为4mmol/L，氯化铁浓度为0.5mol/L，反应时间为10min，水浴时间为15min。关键词：生物催化；腈水解酶；分光光度法；羧酸8181
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New Method of Rapid Determination for Hydrolase Activity
Abstract: Nitrile-hydrolyzing enzymes (nitrilase or nitrile hydratase / amidase) have been widely used in the pharmaceutical industry for the production of carboxylic acids and their derivatives, in order to expand the nitrilase enzyme source, it is important to build a simple, rapid and widely used method of determination of enzyme activity. The ferric hydroxamate spectrophotometry was developed for determination of carboxylic acid in aqueous solutions was developed by the formation hydroxamic acid from carboxylic acid in the presence of hydroxylamine hydrochloride and DCC as well as the formation of purple ferric hydroxamate from hydroxamic acid in the presence of acidic ferric chloride solution. In this assay we optimize the concentration of chromogenic agent, the temperature of the color reation, reaction time for the absorbance. The results illustrate that the best condition of color reaction is: concentration of DCC is 0.2mol / L, concentration of hydroxylamine hydrochloride is 4mmol/L, concentration of ferric chloride is 0.5mol/L, reaction time is 10 min, bath time is 15 min.
KeyWords: Biocatalysis; Nitrilase; Spectrophotometry; Carboxylic acids
目录
1 研究背景 1
1.1 生物催化 1
1.1.1 生物催化简介 1
1.1.2 生物催化的优缺点 1
1.2 生物催化剂 1
1.2.1 生物催化剂简介 1
1.2.2 生物催化剂的来源 2
1.2.3 生物催化剂的筛选 2
1.2.4 常用生物催化剂—酶 3
1.3 生物催化在制药方面的应用 4
1.4 腈水解酶 4
1.4.1 腈水解酶简介 4
1.4.2 腈水解酶的应用 5
1.4.3 腈水解酶的筛选方法研究现状 5
1.4.4 测定羧酸含量的方法的比较 6
1.5 本课题研究的意义及思路 6
1.5.1 本课题研究的意义 6
1.5.2 本课题研究的思路 7
2 实验原理及流程 8
2.1 实验原理 8
2.2 实验流程 9
3 试验方法与材料 10
3.1 实验材料 10
3.1.1 工程菌种子培养基 10
3.1.2 发酵培养基 10
3.1.3 主要试剂 10
3.1.4 主要仪器 11
3.2 试验方法 11
3.2.1 紫外-可见扫描确定最适检测波长 11
3.2.2 优化影响显色反应的条件 12
3.2.3 试验的抗干扰性测定 13
3.2.4 标准曲线的绘制 13
3.2.5 加标回收率 14