新近的研究表明,Rho激酶抑制剂可以使细胞骨架的结构重组,可以激活多种特异性转录因子[6],同时Rho抑制剂还具有促进细胞增殖分化,抑制细胞凋亡等多种生物学效应[7]。但Rho激酶抑制剂是否能通过Ras/MAPK信号通路表达下游转录因子活性,并在Sr诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中起重要作用,目前仍尚不清楚[8]。为此,本文通过4组实验(一组对照、三组实验)在雷奈酸锶的基础上施加特异性的Rho激酶抑制剂Y-2763- 2,观察骨髓间充质干细胞的分裂增殖、分化、蛋白浓度、碱性磷酸酶活性和下游基因表达活性等因素[9],并结合数据与图像分析来探究(1)Sr是否能通过该抑制剂促进rBMSCs向成骨细胞分化;(2)该抑制剂是否能通过阻断某种信号通路进而单独扩增rBMSCs;(3)该抑制剂是否能够促进Sr在rBMSCs向成骨细胞分化中基因的表达。

1材料与方法

1.1主要材料

1.1.1 实验动物

4周龄雄性SD大鼠购自徐州医学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂

低糖DEME/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;Sr干混悬剂购自日本Servier公司;Rho激酶抑制剂Y-27632购自美国Sigma公司;ALP检测试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京碧云天生物技术有限公司;CC K-8活性检测试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司;动物总RNA快速提取试剂盒(Trizol-离心柱型)购自上海捷瑞生物工程有限公司;反转录cDNA试剂、SYBR‖+ROX购自大连TAKARA公司;β—Actin、Runx-2、OST、β—CAT、OPG、OPN、OCN、COL等各种内参、上下游转录因子或基因购自美国GENEray公司。

1.1.3 主要仪器

二氧化碳孵育箱购自美国Thermo公司;倒置相差显微镜购自日本Oly- mpus公司;酶标仪购自美国BIO-TEK公司;定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 主要方法

1.2.1 大鼠rBMSCs的分离纯化、原代培养及传代

取4周龄雄性SD大鼠,断颈处死后用75%乙醇浸泡一段时间,在超净工作台上取下大鼠两侧的股骨与胫骨,剔净周围少量软组织与肌肉。用10 mL注射器将含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔,直到骨髓腔发白。利用注射器反复吹打冲洗液使细胞呈单个状态,将制成的细胞悬液接种在25 cm2培养瓶中(一般一只大鼠的一侧骨髓接种一瓶培养瓶),将其置于二氧化碳培养箱中[10]。24小时后第一次换液,以后每隔2d重新换液一次。每次换液时在倒置相差显微镜下观察其细胞形态特征与生长情况。若观察到细胞贴壁生长铺满瓶底,可用胰蛋白酶消化贴壁细胞,按照细胞量多少1:2或2:3进行传代。一般细胞传代时间间隔为5-7天。当传至P3-P5代时即可用于后续实验研究。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

1.2.2  CCK-8细胞活力与增殖的检测[11]  

  在96孔板中接种第3代rBMSCs,贴壁培养4小时后换液,A组:新鲜的完全培养基;B组:含浓度为10umol/L Y抑制剂的完全培养基[7],C组:含浓度为10umol/LSr的完全培养基;D:含与B和C组同等浓度的Y抑制剂和Sr的完全培养基。放入37℃孵育箱培养。分别在第1、4、7天取出一个96孔板样品,吸去培养基,用PBS冲洗后每孔加入110μL CCK-8与培养基混合溶液,其中CCK-8溶液每孔需10μL ,37℃孵育2h,取出后利用酶标仪在450nm波长下测定其吸光值。以细胞培养日期为横轴,A为纵轴,绘制出细胞生长曲线。

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