β-榄香烯（β-Elemene)作为榄香烯类抗肿瘤药物的主要活性成分，是一种从植物体内提取出来的抗癌药物，相较于其他药物具有毒副作用小，治疗效果显著等优势。吉马烯A合成酶(Germacrene A synthase, GAS)属于植物萜类合酶，这类酶是萜类物质β-榄香烯合成途径中的关键限速酶，它的催化性质和反应速度决定了产物的合成效率。它可以催化FPP合成吉马烯A，吉马烯A可在高温条件下进行内部分子重排生成β-榄香烯。

1。2榄香烯简介

从温郁金(Curcuma wenyujin)的根茎中分离出来的榄香烯是一种倍半萜烯化合物[ ]。β-榄香烯是其主要的活性成份，具有抗肿瘤特性[ ­ ]。目前，β-榄香烯乳剂在临床上主要用于合并放化疗对肺癌、肝癌、鼻咽癌等具有增强疗效，降低毒副作用。其次它对肾和肝的功能都不产生药物诱导毒性，对脊髓也没有抑制作用[ ­ ]，所以对于这类药物的生产和研发一直以来都是国内外研究的热点。

1。3 β-榄香烯的生物合成途径论文网

β-榄香烯的合成途径如下：

图1。1β-榄香烯的合成途径

目前针对β-榄香烯的主要来源是利用先进的合成生物学技术，对其体内生物合成途径进行改造和优化，在微生物细胞中重新构建一条合成途径。

1。4 倍半萜合酶的定点突变研究

倍半萜合酶（Sesquiterpene Synthase）是一类通过替代途径催化法尼焦磷酸（FPP）环化，产生多种环状倍半萜产物的酶。

在研究合成烟草-花椒烯合酶（TEAS）的中间体吉马烯A合酶过程中[ ]，通过Y520F突变成功并入TEAS，相对于未突变的TEAS，Y520F突变导致FPP的KM增加3。5倍。EAS-Y520F从3H-FPP产生的己烷可萃取的3H，催化效率（kcat / KM）约为野生型TEAS的3％。

对青蒿紫穗槐二烯合酶的研究过程中[ ]，Li等指出G1螺旋上的T399侧链羟基的存在影响ADS的催化特异性。这个羟基或许参与区域选择性的去质子化，T399S突变体增加了酶的催化特异性，而且主产物大量增加。 

以上是近几年来国内外对倍半萜合酶突变的部分相关研究，倍半萜合酶能产生出数量众多的萜类化合物[ ]，通过对萜类化合物的深入研究可以在医药应用方面对新药物的开发以及改进生产工艺，提高生产效率都具有重要意义。

1。5定点突变技术

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。它能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。文献综述

1。6本研究目的及其意义

    吉马烯A合酶是抗癌药物β-榄香烯合成途径中的关键限速酶，本课题主要针对吉马烯A合成酶的保守模块和活性中心疏水区域边缘关键氨基酸位点DE（莴苣吉马烯A合酶的第二个DDXXD/T基序的删除）、Y530F和T412S进行改造，研究他们在吉马烯A合酶催化反应中的作用，最终以提高吉马烯A合酶催化反应活性，获得催化效率较高、目的产物产量较高、副产物最少的突变体。

1。7本研究的技术路线

2。实验部分

2。1 实验材料及试剂

2。1。1 菌株和质粒

以大肠杆菌BL21作为宿主菌，用质粒提取试剂盒（台湾惠晶生物科技股份有限公司）提取PET-28a-Lsgas质粒DNA作为模板。