2 材料与方法

2。1 实验材料

半枝莲中药(晒干后,粉碎)；灵芝菌；肿瘤细胞：慢性骨髓性白血病细胞（K562），乳腺癌细胞（MCF7），肝癌细胞（Bel-7404）（注：均来源于苏州吴江第一人民医院）

蒸馏水(H2O)；葡萄糖(C6H12O6)；甲醇试剂(CH3OH)；苯酚(C6H6O)；浓硫酸试剂(H2SO4)；丙酮(C3H6O)。

RPMI1640培养基：用超纯水溶解RPMI1640 10。4 g，再补加碳酸氢钠2g、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL，用7。4% NaHCO3溶液调节pH值至7。0-7。2，滤过0。22 μm 微孔滤膜，于4 ℃冰箱中，保存备用。

胰酶消化液：称取胰酶 0。25 g，用PBS 100 mL溶解，加入7。4% 碳酸氢钠溶液使pH至7。6-7。8，滤过0。22 μm 微孔滤膜（以下简称滤过），于-20 ℃中保管备用。

Alamar blue溶液：称12。5 mg的Resazurin，加入1 L的磷酸盐缓冲溶液中，滤过，放在-80 ℃冰箱，注意避光保存。

2。2 实验设备

电子天平；恒温水浴锅；高压灭菌锅；无菌操作台；破碎机；恒温培养箱；可调控温电热套；旋转蒸发仪；球形冷凝管；移液枪；酶标仪；Agilent 1260 HPLC system，荧光检测器。

2。3 实验方法

2。3。1 样品的制备

2。3。1。1 培养基的配制

称取10g的半枝莲中药两份，置于干燥的锥形瓶中，加入适量的蒸馏水（蒸馏水的量要求全部浸透中药），标号A、B。以麸皮代替半枝莲，按照上述的步骤制成对照组C。三组均密封、标号，再灭菌40分钟，冷却待用。

2。3。1。2灵芝菌的活化

PDA固体培养基灭菌冷却后，倒出适量于培养皿，待干后，接种，待灵芝菌产生菌丝后，挑取适量加到灭菌好的PDA液体培养基中，与26℃摇瓶培养，直到培养瓶中长满了菌球。

2。3。1。3 接种菌种

用破碎机将菌球打碎，将种子液体倒入灭菌后的培养瓶（实验组A、对照组C）中，放在26℃的温度里持续培养60天左右，等菌丝铺满后，持续再培养15天。将三组培养基从瓶中取出（注意将实验组A的菌柄与下面的培养基分开作为两种样品），烘干待用。

2。3。1。4 样品的提取、浓缩

将上述四组烘干的样品，分别倒入圆底烧瓶中，加入适量甲醇[15]使其完全浸没样品。置于可调恒温电热套上，先220伏直热至液体翻滚后，旋转调节至110伏，继续回流提取30min。多次提取，将得到的提取液合在一起浓缩，浓缩至原来的约十分之一即可。取4个样品瓶，标号，将浓缩液倒入标号的瓶子中，静置，待用。

2。3。2 多糖含量的测定（分光光度法）文献综述

2。3。2。1 标准曲线的绘制（苯酚-硫酸法[16]）

2。3。2。1。1 显色剂的配制

先配5%的苯酚溶液，再取5ml 5%苯酚溶液，加入25ml的浓硫酸中(此步骤在冰上进行)，即可。

2。3。2。1。2 标准品的制备

先采用两步法制成葡萄糖溶液（0。4g/l），再用移液枪依次取0,25,50,75,100,125,150,175,200μL加到9个已经做好标记的EP管中，继续补水定容至200μL，再按顺序加入现制的显色剂，各600μL，混匀。先进行冷水浴，再沸水浴，最后冷水降温，（都是5min），摇匀。

2。3。2。1。3 吸光值的测定

用移液枪从上述的九个样品中各取出200μL葡萄糖溶液放在96孔板中，490nm，测定。

2。3。2。2 样品中多糖的含量测定

取12个EP管，做好标记，用移液枪从步骤1所得到的四个样品瓶中各抽取100μL的上清液，再加入900μL的蒸馏水，这是10^-1的浓度梯度，再按照此法依次配制10^-2、10^-3的浓度梯度。再另外取12个EP管，做好标记，分别加入上述配制的不同浓度的样品液200μL，加入现配的显色剂600μL，摇匀。继续各吸200μL，和上述方法一样进行测定。 半枝莲培养灵芝菌过程中化合物的含量分析(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_85835.html