2。3。3 灵芝酸的含量测定

从步骤1所获得的三个样品瓶中抽取适量的上清液，滤过，将所得滤液注到专用的进样瓶内，进行高效液相分析。

方法：选取色谱柱Zerbax C18 （4．6min×150mm，5μm），用水作为流动相A，B是乙腈，选定在254nm，40℃检测：在0~5 min时间内，为80%~75%B；5~25 min内，为75%~65%B；25~30 min内，为65%~55%B。进样控制在20μL，N按灵芝酸A/B/C2/G/E对照品计，要求大于等于4000。

2。3。4 抗肿瘤的活性测定（Alamar blue法[17-18]）

2。3。4。1 细胞的处理

细胞复苏：将冻存的细胞立放进37℃的水中，注意管中的细胞要浸没到水面下方，不断晃动直至它们都化开。在无菌操作台内，取10 mL的细胞培养液至50 mL的培养瓶中，再加入细胞，轻轻摇晃使细胞全部分散开，放入37℃、5%CO2培养箱内（以下简称培箱）。

细胞传代：将复苏好的细胞拿出，先倒完里面的液体，再用PBS清洗，并重复一次，吸加胰酶液1 mL，轻微晃动直到细胞分散开，打开培箱，再将其放入其中大约2-3分钟。取出，使用显微镜，当观察到大部分变圆或者少数已经脱落后，再加入2-3 mL的完全培养基，用移液枪吹吸瓶内的溶液数次，使细胞之间完全分散开。离心，设置1000 rpm，定时8 分钟，后吸走上清，加培养液，摇匀。再取约三分之一，并加入适量培养液，摇匀，置于培箱内。

细胞冻存：将细胞消化完全，再离心，在保证保证细胞浓度维持在1×107/mL的前提下加入适量的细胞冻存液。先4 ℃保存1 h，再转移到-20 ℃里保存1 h，继续转移至-80 ℃中过夜，最后在转移到液氮中。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

细胞接种：将消化完全的细胞液离心，要求约2×104 个/mL，用来作为细胞悬浮液加到96孔板中。

2。3。4。2 抗肿瘤活性的检测

称取待测样品，加入丙酮溶液，溶解后，分别加入完全培养基，使其稀释为实验浓度(粗样为200，100，50，25，12。5，6。125 μg·mL-1，单体为80，40，20，10，5，2。5 μg·mL-1)。实验组为每孔加肿瘤细胞的悬浮液80 µL和样品20µL，空白孔是100 µL不含肿瘤细胞的基本培养基，而以100 µL肿瘤细胞的悬浮液，但没有加待测样品的作为对照值，均放在培箱24 h，倒掉，用新鲜的细胞液洗涤，重复一次，再放在培箱中12h，最后加入用基本培养基稀释十倍的Alamar Blue母液200 µL，在培箱培养4 小时。

使用SpectroMax M2荧光检测仪检测，激发选定570纳米，发射为590纳米，根据抑制率的公式求出每个稀释浓度的值。