云实内生菌Chaetomium globosumYSC5次生代谢产物研究(3)
时间:2018-07-11 21:48 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
二氯甲烷（CH2Cl2）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司； 乙酸乙酯（EtOAc）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司； 二甲亚砜（DMSO）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司； 无水乙醇（CH3CH2OH）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司； 1.1.5 试剂盒 植物基因组提取试剂盒Nucleic Acid Purification N1191 广东东盛生物 广东 PCR Kit P2052 广东东盛生物 广东 凝胶回收试剂盒 purification kit Cat. DP1501，Bioteke Corporation 北京 1.2 实验方法 1.2.1 菌株YSC5的液体发酵 将储存于4 °CPDA斜面培养基上的云实内生真菌YSC5取出，置于超净工作台中无菌操作，取一小块放在含PDA固体培养基的培养皿中央，置于25 °C恒温培养箱内活化培养3d。3d后，将活化好的平板在无菌条件下用圆形打孔器（直径0.5 cm）在近菌落边际打出若干圆形菌饼，用接种针挑选出12个菌饼，放入含有400 mL PD液体并已做过灭菌处理的培养基的1000 mL锥形瓶中，置于旋转式摇床上，以150r/min，25 °C漆黑振荡的条件培养12d。12d后，用100目尼龙网过滤其发酵液，得到其菌丝和发酵液，另部分发酵液经0.22 μm滤膜过滤后获得无菌发酵液（FB），4 °C保存。 1.2.2 菌株YSC5不同有机溶剂提取物的制备 菌株YSC5发酵液分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、依次萃取，浓缩蒸干，得到各有机相萃取物。 1.2.3抗菌活性实验方法 1.2.3.1平板对峙法 内生菌YSC5与植物病原菌平板对峙法采用两点对峙培养法[10]。对内生菌YSC5和9种植物病原菌进行活化，待其菌落长至平板总面积3/4时，将灼烧过的无菌打孔器（直径5 mm）分别在YSC5和病原菌菌落的边缘打取直径为5 mm的圆形菌饼，鉴于病原菌的生长速度快，所以先将内生菌YCS5接种于PDA平板内一条直线的一点上，3d后内接种病原菌的菌丝块处在同一直线的另一点上，且两点相聚4cm。平板背面标记内容包括相对应的菌落名称、日期等，空白对照是只接种病原菌的PDA平板，处理和对照全部设为3个重复。将平板置于25 °C培养箱中恒温培养3-7d左右，每天观察处理组和对照组病原菌菌落、菌丝的生长速度、菌落之间是否有抑菌带出现、菌落边缘菌丝是否有稀疏和萎缩畸形等现象发生。如出现了抑菌带，那么抑菌带（或抑菌圈）面积越大，就表示该内生真菌对该病原菌的抑菌效果越强。 1.2.3.2菌丝生长抑制法 利用菌丝生长抑制法，测得菌株YSC5的发酵液与发酵液的各项有机相萃取物对9种植物病原菌的抑制活性作用。就菌株YSC5发酵液而言，将无菌发酵液和PDA培养基混合倒入平板，稀释10倍，就菌株YSC5不同有机相提取物而言，终浓度为25 μg/mL。含药平板制作完成以后，用直径5 mm无菌打孔器（已灼烧）在YSC5及病原菌菌落的边际打圆形菌饼，放至培养皿中心，于25 °C恒温黑暗环境中培养。直至阴性对照菌株生长至培养皿边缘时，采用十字交叉法计算菌株直径（除去菌饼5 mm），计算抑制率的公式为(1-a/b) × 100%，其中a值代表含药组的菌株直径，b值代表空白对照组的菌株直径，而后用公式计算抑制率。 1.2.3.3化合物有效抑制中浓度（EC50）测定 采用菌丝生长抑制法（见1.2.3.2）测定分离所得化合物对供试植物病原菌（1.1.1）的抑制活性。从中选择供试样品的条件为其对植物病原菌的相对抑制率较高，用供试样品测定计算它的有效抑制中浓度（EC50），过程如下，用二甲亚砜（DMSO）溶解供试样品，将溶液与PDA培养基混合，配制出不同终浓度的含药平板，用打孔器（直径5 mm）在已培养好的植物病原菌菌落上打取菌饼，分别接种到平板的中间位置，每个处理设置3次重复，并以只加DMSO不含样品的PDA平板作为空白对照。25 °C黑暗环境下培养一段时间，采用十字交叉法测定计算菌落直径，得出相对抑制率。实验结果则用Microsoft Excel软件进行数据归纳和整理，将供试样品质量浓度（μg/mL）设为X轴，抑制率（%）设为Y轴，求得抑制活性的回归方程，从而计算出有效抑制中浓度（EC50）。阳性对照是多菌灵。 (责任编辑：qin) |