蜜蜂螺原体黏附相关蛋白对宿主意蜂免疫的影响(4)
时间:2018-07-17 21:08 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
pfu酶 0.5 10 ∞ 扩增出的两个片段用 GenClean 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒(离心柱型)回收，按 照以下程序进行PCR，使片段融合： 表6 ALP609片段融合第一次PCR扩增反应体系及程序 体系 使用量(µ L) 温度(℃) 时间 双蒸水 15.1 94 5 min dNTPs 3 95 30 s 10 × pcr buffer 2.5 55.7 30 s 10 个循环 回收609-3’ 1 72 2 min 回收609-5’ 1 12 ∞ 表7 ALP609片段融合第二次PCR扩增反应体系及程序 体系 使用量(µ L) 温度(℃) 时间 609-3’ 1 94 5 min 609-5’ 1 95 30s pfu酶 0.5 55.7 30s 35个循环 72 2 min 72 10 min 1．2．1．3 表达载体的构建 ALP609片段融合后加 poly-A尾巴，体系： ALP609片段：10 µL Taq mix：25 µ L 双蒸水：15 µL 与T载体混合即可连接，转化至载体 E. coli DH 5α中，具体步骤如下： (1) 将E. coli DH 5α感受态细胞取出待其融化，在超净工作台中，将 10 µ L连接产 物加入刚融化的100 µLE. coli DH 5α感受态细胞中，用移液枪轻柔吹吸混匀，充分混合 后冰浴静置15 min。 (2) 上述混合物 42℃水浴热激 60 s (不要超过 60 s)后，迅速放置在冰上冷却 1 min。 (3) 在超净工作台中向离心管中加入 890 µ L 不含氨苄的 LB 液体培养基，混匀后 37℃，200 rpm 震荡培养 1 h，使菌体复苏。 (4) 将复苏菌体 5000 rpm，离心3 min，舍去 750 µ L上清液，将剩余沉淀重悬为菌 悬液，吸取100 µ L接种至含有氨苄的 LB固体培养基上，涂布均匀，静置 10 min 后放 置于37℃温箱中倒置培养 8~12 h。 挑取转化后的重组阳性菌落，于3 mL含终质量浓度为 50 mg/mL氨苄的 LB液体培 养基，37℃培养6 h，取2 mL摇菌以通用引物 M 13 进行PCR 验证，取 1 mL送于相关 机构测序鉴定。 测序确定该片段为目的基因后将T载体双酶切获取ALP609基因的片段和双酶切的 pET 28 a利用T4 连接酶连接转化至 E. coli DH5α中，再次片段双酶切初步验证目的基因是否连接到质粒上。再次将 ALP609片段和双酶切的pET 28 a利用 T4 连接酶转化到 E. coli BL 21 中，获得的菌株称为 BL 609 菌株。转化具体步骤参见 T 载体的转化，但使 用的培养基为含终质量浓度为 50 mg/mL卡那霉素的 LB液体培养基 1．2．2螺原体黏附蛋白的原核表达与纯化 1．2．2．1 重组质粒在大肠杆菌中的原核表达 将BL 609 菌株接种于 1 mL含50 µg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中，各接两管， 37℃ 180 rpm培养至 OD值为0.6~0.8，一管加入终浓度为1 mmol/L的 IPTG诱导蛋白 表达，另一管加等量双蒸水做阴性对照。26℃诱导3 h，4℃，8000 rpm 离心5 min，收 集菌体沉淀，加入70 µ L双蒸水混匀后煮沸 5 min，12%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情 况。 SDS-PAGE电泳过程如下： (1) 上样体系10 µL：上述蛋白样品20 µL，Loading buffer 5 µL，煮沸 2 min，取 10 µL进行电泳检测，电泳条件为稳压 120 V，电泳至蓝色染液行至电泳槽末端 1 cm 处。 (责任编辑：qin) |