蜜蜂螺原体黏附相关蛋白对宿主意蜂免疫的影响(5)
时间:2018-07-17 21:08 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
(2) 取出玻璃板中的蛋白胶，用考马斯亮蓝染液进行染色，加热 20 s，重复3~5次。 (3) 染色完成后取出蛋白胶，至于脱色摇床上，加入脱色液进行脱色，直至蛋白条 带清晰。 1．2．2．2 重组蛋白纯化 将BL 609菌株按1%接种量接种于500 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，37℃ 180 rpm培养至 OD值为0.6~0.8，加入终浓度为 1 mmol/L的 IPTG，26℃诱导 3 h， 4℃， 8000 rpm离心 10 min，上清液除净，称量细菌沉淀，按照 1 g 菌体/10 mL Binding Buffer悬浮。充分混匀后的菌液经超声波裂解，超声 2 s，间隔3 s，超声 20 min，待裂 解液变得清亮，4℃，10000 rpm离心 40 min，12%SDS-PAGE电泳检测上清液和沉淀。 平衡：上下颠倒 NTA-Ni 2+ 柱使其充分混匀，静置几分钟，柱内 20%的乙醇流尽后， 用4倍镍亲和树脂体积的 Bingding Bufffer 平衡柱子。 纯化条件的优化：NTA-Ni 2+ 柱平衡后加入 10 µ L样品上清液，上样后分别用含有 20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、300 mmol/L咪唑的Elution Buffer 洗涤，各浓度均洗 涤三管，每管2 mL，收集各浓度第一管和第三管的洗涤液，12%SDS-PAGE电泳检测。 检测结果只有单一条带的即为纯化最优浓度。 样品纯化：剩余样品全部加入平衡后的 NTA-Ni2+柱，用含有 300 mmol/L 咪唑的 Elution Buffer洗涤柱子，洗涤 6个柱体积，弃去初始流出的 2 mL洗涤液，收集其余柱 后液，12%SDS-PAGE 电泳检测。 NTA-Ni2+柱后续处理：待电泳检测确认最后一管样品无明显蛋白时，即可处理NTA-Ni2+ 柱，方法如下： (1) 300 mmol/L咪唑溶液洗涤 6倍柱体积； (2) 0.5 mmol/L NaOH溶液洗涤 10倍柱体积； (3) 双蒸水清洗 20倍柱体积； (4) 20%乙醇溶液洗涤 10 倍柱体积，待乙醇全部流出后再加入 2 mL 20%乙醇溶液， 4℃保存。 1．2．3间接免疫荧光验证黏附蛋白的黏附性 将纯化的 ALP609 蛋白免疫宿主意蜂，检测 ALP609 蛋白在意蜂中肠的定位。 1．2．3．1蜜蜂中肠组织细胞分离培养 具体操作步骤： (1) 整只意蜂在 2% NaClO 溶液中消毒 5~10 min； (2) 置于Hank’s 溶液中润洗 2~3 min，润洗两次； (3) 在Hank’s 溶液中分离出中肠，保持中肠完整性； (责任编辑：qin) |