大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(3)
时间:2016-11-23 19:22 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
在上述微生物细胞表面展示系统中，有关有机磷的生物降解一般是利用革兰氏阴性菌表面展示系统和酵母表面展示系统；乘客蛋白则主要采用来自黄杆菌(Flavobacterium) ATCC27551菌株和缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)MG中的有机磷水解酶；而迄今报道的运载蛋白可分为三大类，即在大肠杆菌中使用的人工融合蛋白Lpp-OmpA、来自于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的冰核蛋白和在酵母表面展示体系中使用的α-凝集素[4]。 1.3 存在的问题及展望 目前，INP已用来展示不同种类的外源蛋白并应用于多个研究领域，以INP构建的细胞表面展示体系越来越引起广泛的研究兴趣[16]。虽然细菌细胞表面展示技术已被广泛研究和应用，但这一技术还有局限性：一、细菌细胞表面展示体系对乘客蛋白的大小有限制，往往只能展示分子量较小的蛋白质，大分子量蛋白质与运载蛋白的融合表达往往影响到跨膜运输，使得融合蛋白表面展示效率降低；二、载体蛋白与乘客蛋白结构容易互相影响，尤其是分子内含有二硫键或需要帮助折叠成正确构象的乘客蛋白，一旦与运载蛋白融合就会干扰其正确折叠，从而降低乘客蛋白的活性；三、外源蛋白的过量表达给宿主菌带来负担，不利于宿主菌的正常生长代谢，有些甚至导致宿主菌的死亡；四、目前细胞表面展示体系的构建是基于细菌质粒载体，而质粒上往往含有抗生素抗性基因，这样构建的工程菌含抗生素抗性，限制了细菌细胞表面展示的推广应用。 1.4 本课题的研究目的和意义 INP是近十几年发展起来的一种应用于表面展示的运载蛋白，它的诸多优点使其广泛应用于多个领域的研究。然而，INP的分泌锚定机制目前了解不多，尽管已有报道利用INP的N末端作运载蛋白就能高效展示外源蛋白于细菌细胞表面，但绝大多数利用INP构建的细胞表面展示体系都采用截取的N和C末端融合后作为运载蛋白。本研究即基于前期研究工作的基础，以INP的N端结构域构建的细胞表面展示体系为研究对象，以绿色荧光蛋白GFP为报告蛋白，优化培养和诱导条件，获得能够稳定展示外源蛋白的表面展示体系，为其应用奠定基础。 2材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌株与质粒 （1）菌株：E.coli DH5α、E.coli JM109、重组菌MB108(含质粒pMB102的E.coli DH5α)； （2）质粒：pMB102(pTrcHis-C插入inaQ-N/gfp融合基因)。 2.1.2 培养基配方及培养条件 本研究中各培养基配方如下： LB培养基(Luria—Bertani)：NaCl 10.0g，胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.2。 M9培养基：Na2HPO4•7H2O 12.8 g，KH2PO4 3.0 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，CaCl2 3.0 mg，MgSO4 1.0 mM，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.2。 如无特别说明，大肠杆菌在37oC条件下培养，大肠杆菌转化子的筛选和重组菌培养所用抗生素终浓度为：氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：100 ug/mL。 固体培养基为以上各培养基中加入1.5％的琼脂粉。 E.coli用LB培养基。MB108的诱导表达用含氨苄抗性的M9培养基。LB培养基是一种培养基的名称，生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。通过培养工程菌，我们可以表达大量的外源蛋白，也可以拿到带有外源基因的质粒，工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础。 2.1.3 试剂 2.1.3.1 主要分子生物学试剂 DL2000DNA分子量Marker，λHindIIIDNA分子量Marker，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白酶购自Sigma公司。 (责任编辑：qin) |