大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(4)
时间:2016-11-23 19:22 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)配方如下：在8 ml蒸馏水中溶解2 g IPTG后，用蒸馏水定容至10 ml，用0.22 μm滤器过滤除菌，分装成1 ml小份贮存于-20℃。 2.1.3.2质粒提取试剂 溶液Ⅰ：50.0 mrnol/L Glucose，25.0 mmol/L Tris•HCl (pH8.0)，10.0 mmol/L EDTA (pH8.0)； 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS； 溶液Ⅲ(每100 mL)：5.0 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL； TE：10.0 mmol/L Tris•HCl，1.0 mmol/L EDTA (pH8.0)； 2.1.3.3 琼脂糖凝胶电泳所需试剂 TAE Buffer：40.0 mmol/L Tris-乙酸，1.0 mmol/L EDTA (pH8.0)； 2.1.3.4 GFP荧光强度测定所需试剂 PBS(PH 7.4)：NaCl 4.0 g，KCl 0.1 g，Na2HPO4•12H2O 1.45 g，KH2PO4 0.135 g，去离子水定容至0.5 L，调PH至7.4。 2.1.4 仪器设备 可见光分光光度计，高速冷冻离心机，凝胶电泳仪，凝胶成像仪，荧光分光光度计。 可见分光光度计基本使用方法： ① 按“GO TO λ”键，输入设定波长； ②四个比色皿，其中R位置放置参比试样，其余三个放入待测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，盖上样品池盖； ② 将参比试样推入光路，按“ABS%”键，使仪器自动调零和置满度； ④然后将待测试样推入光路，显示试样的吸光度值； 高速冷冻离心机基本使用方法： ①检查仪器。 ②选择转头。 ③接通电源，打开电源开关。 ④将待离心的液体装入合适的离心管中，并对称的放入转头中。 ⑤调节速度和时间。 ⑥打开开关。 ⑦离心结束后自动关机、关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。 ⑧将转头取出，将离心机的盖子敞开放置。 ⑨收集离心物，洗净离心管。 2.2 实验方法 2.2.1 质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定 2.2.1.1 大肠杆菌质粒DNA的少量提取 （1）实验原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH 12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快速，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去[17]。 （2）实验方法 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，本次实验采用了碱裂解法和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取法两种方法： 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： ①接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2 ml LB培养基，37℃振荡培养过夜。 ②取1.5 ml菌体于Ep管，以12000 g离心30 s，将剩余培养物贮存于4℃。 ③弃上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。 ④将细菌沉淀重悬于100 ul用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡。 ⑤加入200 ul新配置的溶液Ⅱ。加入150 ul用冰预冷的溶液Ⅲ。 ⑥用微量离心机于4℃以12000 g离心5 min，将上清转移到另一Ep管中。 ⑦用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2 min。 ⑧用微量离心机于4℃以12000 g离心5 min。 ⑨小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 ⑩用1 mL 70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤10所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10 min。 （3）SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取法： (责任编辑：qin) |