大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(6)
时间:2016-11-23 19:22 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
Bgl Ⅱ 0.5 ul 质粒 8.0 ul 双蒸水 9.0 ul 总体积 20.0 ul ②先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。 ③用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取0.5 μL限制性内切酶。 ④在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中37℃温育4 h。 ⑤酶切后取少量酶切产物与DL2000DNA分子量Marker，λHindIIIDNA分子量Marker对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。 ⑥酶切后的质粒可以回收备用。 ⑦清理桌面垃圾，清洗实验仪器。 2.2.2 质粒的转化 （1）实验原理 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热激处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 （2）实验方法 将提取出的质粒pTrcHisC-inpN-gfp转化到JM 109中，具体步骤如下： ① 接JM 109于5 mL LB培养基中，37℃，200 rpm振荡培养过夜。 ② 取50 uL接种于5 mL新鲜LB培养基中，37℃培养至对数期（约3-4 h，OD600=0.6-0.8）。 ③ 收集菌体，8000 g下4℃离心1 min。 ④ 用500 ul预冷的0.1 mol/L的CaCl2洗涤后，重悬于500 ul 0.1 mol/L的CaCl2中2 h。 ⑤ 重悬于200 ul预冷的0.1 mol/L的CaCl2中，加1 ul质粒，冰上静置30 min。 ⑥ 42℃热激90 s（严格）。 ⑦ 立即冰上静置1-2 min。 ⑧ 直接涂含Amp的LB平板，37℃过夜培养。 2.2.3 细菌的细胞表面定位实验方法 2.2.3.1 绿色荧光蛋白（GFP）荧光活性的测定 收集相应菌体，用PBS洗涤一遍，再用PBS重悬并调整菌液浓度至OD600为1.0。用荧光分光光度计测量菌液荧光强度，激发波长（Ex）为495 nm，发射波长（Em）为510 nm[2]。 2.2.3.2 大肠杆菌表面展示体系IPTG诱导浓度的优化 挑取MB l08单个菌落，接种于含有Amp(终浓度100ug/mL)的5 mL M9液体培养基中，37oC过夜培养，按1/100的接种量接种子9瓶含Amp的5 mL新鲜M9培养基中，37 oC振荡培养至对数生长期(OD600=0.6-0.8)时，分别向每瓶菌液中加入IPTG，使其终浓度为0 mmol/L，0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3 mmol/L，0.4 mmol/L，0.5 mmol/L，0.8 mmol/L，1.0 mmol/L。室温震荡培养24 h，按照2.2.3.1的方法检测GFP荧光强度。 2.2.3.3 大肠杆菌表面展示体系IPTG诱导温度的优化 挑取MB l08单个菌落，接种于含有Amp的5 mL M9液体培养基中，37℃过夜培养，按1/100的接种量接种于4瓶含Amp的5 mL新鲜M9培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(OD600=0.6-0.8)时，向每瓶菌液中加入IPTG(优化的IPTG浓度)，分别置于15℃，20℃，28℃，37℃震荡培养24 h，按照2.2.3.1的方法检测GFP荧光强度。 2.2.3.4 大肠杆菌表面展示体系IPTG诱导时间与菌体生长关系 挑取MB l08单个菌落，接种于含有Amp的5 mL M9液体培养基中，37℃过夜培养，按1/100的接种量接种于含Amp的新鲜M9培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(OD600=0.6-0.8)，分别测定菌落OD600值和GFP荧光强度，加入IPTG(优化的IPTG浓度)震荡培养，每隔4 h取一份培养液样品，用PBS洗涤并重悬，分别测定OD600值和GFP荧光强度。保持吸光值测定范围在0.5-0.8之间，当吸光值超过这个范围时，应用PBS按一定比例稀释0.5-0.8，所得的值乘以稀释倍数即反映真实的细菌浓度。 (责任编辑：qin) |