产精氨酸脱亚胺酶工程菌的固定化(3)
时间:2019-10-05 09:43 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2.4 精氨酸脱亚胺酶概况 据文献报道，天冬酰胺酶是一种常见的用于抑制肿瘤细胞生长的酶类。它被成功运用于治疗一些癌症，并有明显的临床效果，但天冬酰胺酶毒副作用比较明显，对肝脏功能等有交强的损害。人们积极地寻找天冬酰胺酶的替代酶，发现精氨酸脱亚胺酶不仅具有较强的抗癌效果，相对于天冬酰胺酶毒副作用更小，从而得到了更为广泛的认可[9]。 精氨酸脱亚胺酶催还精氨酸脱亚胺反应生成瓜氨酸，而精氨酸在人体内属于半必须氨基酸，合成速度很慢，并且癌细胞不能合成精氨酸。将精氨酸脱亚胺酶转移到有癌细胞的内环境中，精氨酸脱亚胺酶消耗精氨酸，使癌细胞不能得到精氨酸用于合成蛋白质，从而抑制了癌细胞的增殖。最新研究也表明，精氨酸脱亚胺酶不但能够在体外表现出对多种恶性肿瘤细胞有抑制作用，还能对体内的恶性肿瘤细胞起到明显的抑制作用[10-11]。 1.2.5 精氨酸脱亚胺酶工程菌概况 较早的研究报告的精氨酸脱亚胺酶来自衣原体。衣原体是一种病原微生物，存在一定的致病风险和生物危害，并且衣原体是一种寄生生物，培养成本高，培养条件要求苛刻，不利于大规模发酵生产精氨酸脱亚胺酶。而本实验使用的精氨酸脱亚胺酶大肠杆菌工程菌是生物毒害小的微生物，能有效保证参与操作的人员和环境的生物安全性。另外所使用的精氨酸脱亚胺酶大肠杆菌工程菌培养条件温和，利于发酵生产[12-13]。 目前生产瓜氨酸的菌株大多是通过诱变筛选得到的。这样的菌株存在遗传性状不稳定，产瓜氨酸效率不高等局限性。所以通过转基因技术培养遗传性状稳定的精氨酸脱亚胺酶工程菌是具有极高价值的。本次研究是简历在精氨酸脱亚胺酶工程菌的基础上的，本次研究使用的是李大力老师实验室已构建好的精氨酸脱亚胺酶大肠杆菌工程菌。 该产精氨酸脱亚胺酶工程菌过程大致如下：从提取野生的恶臭假单胞杆菌DNA，切取精氨酸脱亚胺酶基因用PCR扩增，将目的基因精氨酸脱亚胺酶基因链接到T载体上，然后将重组基因载体导入感受态大肠杆菌中，培养该大肠杆菌。由于T载体上有卡那霉素抗性基因，所以成功导入重组载体的工程菌是具有卡那霉素抗性的，并且精氨酸脱亚胺基因插入到了一个乳糖操纵子上，所以目的基因可由乳糖诱导产生。培养基因工程菌后用乳糖诱导，破碎细胞后通过测定精氨酸脱亚胺活性和SDS-PAGE电泳检测精氨酸脱亚胺酶蛋白。从而确定工程菌构建成功与否。另外由于工程菌具有卡那霉素抗性，在培养和发酵过程中始终采用卡那霉素筛选工程菌，减小杂菌污染对实验结果的影响[14]。 1.3 本次研究的意义 本课题同固定化工程菌的方法在摇瓶培养条件下实现了由精氨酸生产瓜氨酸，而且转化效率较高，固定化的工程菌不仅有利于产物和工程菌的分离使产品纯度受工程菌掺入影响小[18]，减少了分离产品的成本[17]。同时固定化的工程菌能够简便的回收重复利用，这也使得工程菌的利用率大大提升，达到了节省诱导培养工程菌的时间和工作量，也起到了提高生产效率和节约成本的效果[15-16]。本实验为大规模发酵生产瓜氨酸进行了初步探索。 同时在实验前期参考以前相关的实验结果发现，从该工程菌中直接提取精氨酸脱亚胺酶，由于工程菌中产精氨酸脱亚胺酶基因的大量表达使得精氨酸脱亚胺酶这一胞内酶在细胞内浓度较大，形成了精氨酸脱亚胺酶包涵体[19]。而使包涵体在胞外实现该包涵体蛋白质高级结构的正确排列是困难的[20]，所以后续直接利用精氨酸脱亚胺酶催化精氨酸的反应研究难以进行，所以才有了本次实验对工程菌固定化的研究。 (责任编辑：qin) |