产精氨酸脱亚胺酶工程菌的固定化(4)
时间:2019-10-05 09:43 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
2 精氨酸脱亚胺酶 2.1 精氨酸脱亚胺酶活性的检测 通过检测产精氨酸脱亚胺酶工程菌中精氨酸脱亚胺酶的活性可以确认工程菌的生长情况。 2.1.1 酶活测定原理 精氨酸脱亚胺酶催化L-精氨酸（L-Arg）产生L-瓜氨酸（L-Cit）的反应式： L-Arg + H2O 精氨酸脱亚胺酶 L-Cit + NH3 在反应液中加入H2SO4吸收精氨酸脱氨后产生的氨生产(NH4)2SO4，(NH4)2SO4在480nm处有特征吸收峰，通过测定吸光度来确定反应生成的氨的量，计算出一定时间内精氨酸脱亚胺酶催化产生瓜氨酸的量，从而确定酶的活度[21]。 2.1.2 酶活标准曲线的制作 在测定酶活的过程中需要通过测定反应液中(NH4)2SO4的浓度，所以必须制作(NH4)2SO4浓度对应吸光度标准曲线。参考文献发现(NH4)2SO4浓度小于0.12%时，吸光度与(NH4)2SO4浓度呈线性关系，所以标准曲线应选取小于0.12%浓度的(NH4)2SO4绘制，待检测的反应体系(NH4)2SO4也应稀释确定倍数到0.12%以下来测定吸光度。 本次绘制的标准曲线选取了多个低于0.12%(NH4)2SO4溶液来确定标准曲线，利用计算机拟合得到一元的线性方程，同时计算出相关系数。 2.1.3 酶活测定的步骤 工程菌破碎后离心取上清得到精氨酸脱亚胺粗酶，取100 µL 待测粗酶液，加入500µL 1%精氨酸溶液，混合均匀后25℃反应5min。加入400µL 1mol/L H2SO4吸收精氨酸脱氨后产生的氨生产(NH4)2SO4。取一支试管，依次加入8mL水，1mL反应液并加入1mL纳氏试剂终止反应。震荡摇匀后再480nm处测定溶液的吸光度。在氨浓度标准曲线上读出氨浓度，从而折算出酶活度。 (责任编辑：qin) |