pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对AHL信号分子生成的影响(4)
时间:2017-03-13 13:05 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.6本课题研究的内容和意义 内容：本课基于已有研究基础，比较野生型、突变型二者在不同上清液（WT上清液，mutant上清液）中的生长速率的差异，对所得的数据进行分析，以判断出突变株是否产生AHL以及pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对AHL信号分子生成的影响。 意义：本课题的研究开始不再以野生菌株为主，而是以突变株为主，研究结果的获得将有助于我们更好的运用基因手段对细胞的“自杀”行为进行控制，可以朝着我们所需控制“优势菌群”和“劣势菌群”。 将有助于探索出更高层次的基因线路以便提出更新的技术平台，加速合成生物学的发展。包括组织修复与再生、个性化医疗以及智能药物研究在内的多个医学领域都将受益于合成生物学的研究成果。 2使用的材料试剂、仪器设备和采取的方法、技术 2.1使用的材料试剂、仪器设备 材料与试剂：Wildtype菌株、1408菌株、107菌株、125菌株、top10F菌株、LB液体培养基（25g/L）、LB固体培养基（40g/L）、胰蛋白胨（tryptone）、KCl、、MOPS、IPTG（浓度为100mM，使用时稀释100倍）、卡那霉素（浓度为1000mM使用时稀释1000倍）、氯霉素（浓度为1000mM使用时稀释1000倍）、水、去离子水、75%酒精。 Wildtype菌株：以top10F’为宿主，pPopctrl为质粒，在30℃温度的培养下，IPTG的诱导下，生成AHL，当其达到阈值时，产生群体感应。 1408菌株：在适当条件下，Wildtype菌株培养14h后产生的突变株，pPopctrl 质粒中在luxR和luxI基因间插入Tn5转座子。 107菌株：以top10F’为宿主，pLuxCcdB3为质粒。 125菌株：以top10F为宿主，pLuxR2为质粒。 top10F菌株：不含任何质粒。 107’菌株：提取125菌株的质粒转化到107菌株中，得到新型质粒，命名107’菌株。该菌株包含pLuxCcdB3、pLuxR2两个质粒，但是不包括LuxI，在IPTG作用下，无法产生AHL；但是由于存在pLuxCcdB3质粒，可以利用AHL启动，产生CcdB毒蛋白，在没有抗体的情况下，发生自杀。因此，可利用该菌株验证AHL是否存在。进而证明突变菌株中pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对AHL信号分子生成的影响 各菌株质粒图谱如下：①Wildtype菌株质粒： ②125菌株：③107菌株：仪器设备：试管、24孔板、96孔板、移液管（5mL、10mL）、移液枪（100ul、200ul、1000ul）、涂布棒、250mL三角瓶、1000mL三角瓶、接种环 、烧杯 、量筒 、玻璃棒、锥形瓶、灭菌锅、微量比色皿、煤气灯、分光光度计、酶标仪。 2.2 采取的方法 2.2.1 培养基配制 （1） LB液体培养基：（25g/L）一般称取5.0gLB液体粉末倒入500ml的三角烧瓶中，加入200ml蒸馏水，搅拌溶解。配方：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，1000ml蒸馏水。 （2） LB固体培养基：（40g/L）一般称取20.0gLB固体粉末倒入1000ml的三角烧瓶中，加入500ml蒸馏水，搅拌溶解。配方：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，20g琼脂，1000ml蒸馏水。 （3） TBK培养基：一般按配方比例配制300ml，调节PH至5.71。配方：10g胰蛋白胨，7g氯化钾，20.93gMOPS，1000ml蒸馏水。 LB固液体培养基准确称量，TBK培养基按下表所示配方配好后，放入121℃灭菌锅中灭菌20分钟，拿出后冷却至50左右，按稀释一千倍的比例加入卡那霉素，摇匀备用。LB固体培养基加好卡那霉素后倒入24孔板中，凝固后倒置备用。 培养基的pH值用pH计测量。pH计的使用方法为：预先将厂家附赠的试剂粉末配置好pH6.86和pH4.13的溶液，测量当下液体温度并在pH计上显示的温度调整到当下温度，将模式切换到pH测量，将电极棒浸入pH为6.86的溶液中轻轻搅动，待数值稳定后将定位数值调到6.86后用蒸馏水冲洗电极棒，然后将电极棒浸入pH为4.13的溶液中轻轻搅动至数值稳定后将斜率的数值调到4.13，然后就可以测定培养基的pH值了。pH值的调节使用盐酸和氢氧化钾。 (责任编辑：qin) |