pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对AHL信号分子生成的影响(5)
时间:2017-03-13 13:05 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
2.2.2 基本操作 扩菌：取5毫升LB液体培养基放入试管，接种一个单菌落，将试管放入37℃、250rpm/min的恒温摇床中过夜培养12小时。 接种：菌液以1：1000的比例接种到TBK培养基中，30℃、250rpm/min的恒温摇床中过夜培养12小时。 上清液：将培养过菌株的TBK液体进行9000r/min高速离心，取上清液并加入相应抗生素。 测OD600：从试管中取200毫升到96孔版中，用矿物油密封，用酶标仪测OD600。 CFU：取20ul加入180ul无菌水中进行一定梯度的稀释，然后取10ul菌液加入已倒好LB固体培养基的24孔板中，轻微地摇晃均匀。放入37℃培养箱中静置培养，半小时后倒置。培养20小时左右拿出计数。 感受态细胞的制备与转化：利用SSCS试剂盒一步法制备感受态细胞。 2.2.3 质粒的抽提、检测、转化 (1) 利用SanPerp柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行Wildtype、1408、125、107菌株的质粒抽提，并做好标记。具体操作如下: 1．加1.5ml的已扩好的菌液到1.5ml的离心管中，9,000rpm、离心5min。弃上清，尽可能倒干，收集菌体沉淀。 2．重复步骤1。 3．重复步骤1。 4．加250µl的Solution I重悬菌体沉淀，轻轻地混匀，静置5min。 5．加250µl的Solution II到已混匀的菌体沉淀中，轻轻颠倒6~8次，混匀，室温下放置3min。 （注：阻止染色体DNA的污染，不可有激烈的漩涡，整个溶解时间不能超过5min。） 6．加350µl的Solution III，轻轻地混匀，室温下放置5min，然后12,000rpm、离心10min。 7．小心吸取上步的上清液（约600µl）至EZ-吸附柱中，8,000、离心2min。 8．倒掉收集管中的废液，加入500µl的Wash Solution（漂洗液）于离心吸附柱中，10,000rpm、离心1min。 9．重复步骤8。 10．打开离心管加热器，调至60℃。 11．倒掉收集管中的废液，10,000rpm、离心2min，尽量除去Wash Solution中的乙醇。 （注：打开吸附柱的盖子，再在室温下静置10min，以挥发剩余的乙醇。） 12．将Elution Buffer（洗脱缓冲液）放入离心管加热器中加热至60℃。 （注：Elution Buffer加热至60℃可提高提取的效率。） 13．取出离心吸附柱将其套入一个干净的1.5ml的离心管中，在硅基质膜中央部位加入50µl已加热至60℃的Elution Buffer，室温放置2min，然后10,000rpm、离心2min。 （注：加入Elution Buffer时必须缓慢滴入，不冲破硅基质膜。） 14．将目的质粒DNA标记好名称保存于﹣20℃。 (2) 利用琼脂糖凝胶电泳法进行质粒检测。具体操作方法如下： 1． 稀释TAE电泳缓冲液，将1×50TAE缓冲液稀释50倍，如20mlTAE加入到980ml的蒸馏水中。 2．用蒸馏水将电泳槽，制胶器和梳子冲洗干净，放在水平的桌面上，在电泳槽中倒入稀释好的TAE电泳缓冲液。 （注：电泳槽中的TAE电泳缓冲液可循环使用。） 3．用电子天平称量0.3g的琼脂糖倒入干净的三角瓶中，量取30ml1×TAE缓冲液加入到三角瓶中，微波炉加热约30s，使三角瓶中溶液沸腾持续约10s，取出三角瓶至室温冷却。 （注：根据所需凝胶的大小，增减琼脂糖和缓冲液的量。加热时，沸腾时间不足琼脂糖溶解不完全，太长会溢出，短时多次加入，溶解要均匀。） 4．待琼脂糖冷却至约50℃，用移液枪加入1µlEB，摇匀。 （注：要及时摇匀，不然形成的凝胶会有色差，导致观察困难。） 5．将琼脂糖小心倒入制胶器，避免产生气泡，迅速在一端插入梳子。 6．待胶完全冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶同制胶器一起放入电泳槽，补加1×TAE缓冲液使液面高于凝胶表面约3~5mm。 (责任编辑：qin) |