pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对AHL信号分子生成的影响(6)
时间:2017-03-13 13:05 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
（注：不要使加样孔有气泡，若有气泡，用细枪头轻轻捣出。） 7．剪1长条封口膜，用移液枪先后移取7.5µl ddH2O、1.5µl loading buffer和6µlDNA样品溶液，用枪头混合均匀后，加入样品孔内，留出最左边的加样孔加2µl Marker。 （注：loading buffer/（ddH2O+ loading buffer+DNA样品）=1/10，DNA样品一般不少于6µl。加样时枪头要伸到液面以下，靠近加样孔，连续缓慢的加入样品。ddH2O、loading buffer、DNA样品、Marker冰浴融化。） 8．连通电源，电压为3~6V/cm（长度以两个电极之间的距离计算），红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动。 （注：一般实验电压为120V，靠近加样孔一端为负极即黑色。） 9．根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般待溴酚蓝的蓝色条带电泳到凝胶的3/4处时即可终止电泳。 10．戴上手套，取出凝胶，凝胶成像仪观察电泳带及位置，并与Marker比较。 （3）SSCS一步法制备感受态细胞（包含转化）。具体操作如下： 1．扩菌：取5ml LB液体培养基（with kan）放入到已灭菌的试管中，接种一个107单菌落，将试管放入37℃、250rpm的恒温摇床中培养。 2．取1ml上步扩好菌液（A600nm约0.35~0.4）到1.5ml的微量离心管中。 （注：取200µl菌液于新的96孔板中，用酶标仪测量A600nm，如菌液未到0.35，则继续培养，之后再去200µl菌液再测，直到菌液处于0.35~0.4间。） 3．4,000rpm离心5min，彻底去除上清液，再加0.1ml的预冷（4℃）的SSCS溶液轻轻悬浮菌液。 4．加入1µl质粒用于转化DNA。 5．混匀DNA和细胞且在冰上放置30min，然后在42℃的离心管加热器中放置90s，再在冰上放置15~20min。 （注：事先将离心管加热器调至42℃。） 6．加0.8ml的LB液体培养基（with kan）到离心管中而后在37℃,250rpm下培养1h。 7．将细胞（离心管中液体取100µl）涂布于相应抗性(Kanr+ Cmr )的平板上，37℃培养0.5h后倒置培养约18~30h。 2.2.4 CFU数据测定 (1) 扩菌与接种培养 先将所需菌株WT，1408在LB（含卡那霉素）液体培养基中进行37℃，250r/min扩菌培养15h，再按1：1000的比例将其接种到有抗性的TBK（含卡那霉素）培养基中30℃，250r/min 培养12h,同时将107’在LB（含卡那霉素与氯霉素）液体培养基中进行37℃，250r/min扩菌培养15h。 (2) 制备上清液 12h 1mM-IPTG TBK培养基上清液：9mL1mM-IPTG TBK对细菌进行12h的培养后，9000rpm/min离心10min，弃菌体沉淀，上清液用细菌滤器过滤除菌或加入氯霉素后作为培养基待用。 (3) CFU测定 将107’菌液按1：100的比例分别加入上清液中30℃，250r/min进行培养，从0时刻起，每隔1小时取样，将取得的样品进行适当稀释涂布到含氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃恒温培养12~18h，计数。 2.2.5酶标仪法测定生长曲线 (1) 扩菌与接种培养 方法同2.2.4 (2) 制备上清液 方法同2.2.4 (3)酶标仪法测定OD600 将WT、1408、107’菌液按1：100的比例分别接入上清液中，摇匀，将接种过的上清液200uL按顺序加入96孔板中，加入50uL矿物油密封，运行酶标仪，测定其OD600（生长曲线）。 酶标仪运行步骤： 1. 双击桌面上的Gen5软件图标，出现操作界面 ； 2. 在操作界面上选择新建实验方案 ； 3. 选择操作的板型：96 WELL PLATE ； 4. 设定检测方法为：吸光度A600nm ； 5. 设定振板时间：20s ； 6. 设定操作温度：30℃ ； 7. 设定开始动力学： (责任编辑：qin) |