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3.9 大肠杆菌质粒pUC57的提取 16

3.10 兽疫链球菌感受态细胞的制备及电转化 16

3.11 兽疫链球菌的摇瓶发酵 17

3.12 摇瓶发酵数据的监测 19

致  谢 21

参考文献 22

1 引言

1.1 透明质酸（HA）的概述

1934年，Mcyer和Palmer自牛眼玻璃体内提取分离得到一种大分子多糖，命名为透明质酸透明质酸（HA），它是一种黏性多糖，是由葡萄糖醛酸（GlcUA）和N-乙酰葡萄糖铵（GlcNAc）以β-1-3糖苷键和β-1-4糖苷键交替连接的二糖单位重复构建而成的高分子链状聚合物，其平均分子量可达106~107Da。结构见图1.1。

图1.1 透明质酸的结构

在水溶液中，HA的分子链会扩展成随机的线圈状，直径约为500nm，且HA分子的每一个单体都含一个羟基，生理条件下可解离成阴性离子，负离子之间相互排斥，于是它的分子处于松散状，占据大量的空间，可结合多于本身1000倍的水分子。

当HA达到0.1%后，HA会形成网状结构，使其具有特异的流变学性质，而该特性是HA具有粘弹性和发挥生理功能的基础。这些性质主要决定于其分子量的大小和浓度。

1.2 HA的分布文献综述

自然界中，HA广泛存在于动物的各种组织内，例如结缔组织、皮肤、脐带、人血清、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉壁中都含一定量的HA。哺乳动物体内，玻璃体、脐带和关节滑液中HA含量最高，而鸡冠中的含量与关节滑液中的相似。在这些组织中，HA经常会与蛋白相结合，并与其它粘多糖共存，在玻璃体和滑液中以溶解的形式存在，在脐带和鸡冠中则以凝胶的形式存在[3]。

表1.1 透明质酸在脊椎动物体内的分布

组织、体液或菌体 浓度mg/L

人 脐带 4100

关节滑液 1400-3600

血浆 0.03-0.18

玻璃体 140-338

羊水（16周） 21.4

唾液 0.46

羊 关节滑液 540

玻璃体 260

血浆 0.12-0.31

鸡 鸡冠 7500

大鼠 肌肉 4.69

1937年，Kendall等[1,2]发现链球菌也可以合成HA之后，又陆续报道了很多可以产HA的菌株。主要为A类链球菌（如：化脓链球菌）和C类链球菌（如：兽疫链球菌）。

1.3 HA的生物合成

透明质酸是由UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）和UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）在透明质酸合成酶的作用下聚合而成的，如图1.2。UDP-GlcA是糖醛酸途径的中间产物，和UDP-G1cNAc一样，它们的形成都不用破坏葡萄糖骨架。UDP-GlcA是葡萄糖在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-葡萄糖脱氢酶这两个关键酶的作用下形成的。而葡萄糖经EMP途径形成6-磷酸果糖，然后形成6-磷酸葡萄糖胺，接着在乙酰基转移酶和焦磷酸化酶的作用下形成UDP-N-乙酰-D-葡萄糖氨。其中磷酸葡萄糖异构酶受UDP-G1cNAc的反馈抑制。HA合成酶(hualuronan synthase, HAS)是HA合成途径中的关键酶，该酶位于原生质体膜上。HAS包括7个结构域，即2个UDP-底物结合部位、2个单糖一UDP供给部位、2个糖基转移酶催化位点和1个协助HA糖链跨膜的结构域。合成过程中，HA多糖链的最后一个残基释放UDP，然后在HAS的作用下，依次连上UDP-GlcNAc和UDP-GlcA。每连接一个二糖单位，消耗5个ATP、2个NADH和1个乙酰辅酶A。在糖链的还原端延长的同时，糖链被挤压到细胞膜外。论文网 (责任编辑：qin)