基于重叠延伸PCR技术构建APECE058株的基因缺失株(3)_毕业论文

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基于重叠延伸PCR技术构建APECE058株的基因缺失株(3)

DAX-9082B

电泳仪 北京市六一仪器厂 DYY-6C

实验室级超纯水器 EPED(易普易达) EPED-T-60A

小型离心机 eppendorf Centrifuge 5418

台式高速冷冻离心机 eppendorf Centrifuge 5810R

电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 DKZ-1

电磁炉 尚朋堂 SR1603-A

超低温冰箱 Haier(海尔) L286

1.5 PCR相关材料

本实验使用的引物由赛百盛公司合成,引物合成相关序列如下。

表5 引物合成单

Name Sequence(5'> <3')

ssrA1-F GGC TGA TTC TGG ATT CGA CGG

ssrA1-R GTT ATT AAG CTG CTA AAG CGT AG

ssrA2-F GAA GCG TTA AAA CTT AAT CAG GCT AG

ssrA2-R GTG GAG CTG GCG GGA GTT GAA CC

ssrA-PKD3-F CTA CGC TTT AGC AGC TTA ATA ACG CAG CAT TAC ACG TCT TGA GCG

ssrA-PKD3-R CTA GCC TGA TTA AGT TTT AAC GCT TCG ACA CAG GAA CAC TTA ACG GCT G

smpB1-F GAC GAA GAA AAA AGC AGA TAA ACC

smpB1-R CGT AGC TGT CGC TGA TAT TGG

smpB2-F GCG TCA ATC GAG AAG GCT ATA C

smpB2-R GAT ACG TGC TTT ATC CAC CTG C

smpB-PKD3-F CCA ATA TCA GCG ACA GCT ACG GCA GCA TTA CAC GTC TTG AGC G

smpB-PKD3-R GTA TAG CCT TCT CGA TTG ACG CGA CAC AGG AAC ACT TAA CGG CTG

表6 PCR试剂说明

PCR试剂名称 来源

10×Taq酶反应缓冲液 北京佳兰

dNTPs 10mM 北京佳兰

Taq酶 5U 北京佳兰来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com

2×Pfu PCR Mix 北京佳兰

表7 其他说明

名称 用途 来源

AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 凝胶回收试剂盒 AXYGEN

2 实验步骤

2.1 复苏及扩增大肠杆菌

按照表3试剂比例配制新鲜的LB固体培养基[3],在无菌操作台中,将保存于本实验室-70℃的野生大肠杆菌E058样本用接种环蘸取菌液,涂布在不含任何抗生素的LB固体培养基上,全温度恒温培养箱中37℃过夜培养[4]。

第二天,在无菌操作台中操作,取1mL的LB液体培养基至1.5mL离心管中[5],挑选单菌落放入离心管中,置于37℃,转速200rpm摇床中,过夜培养至培养基浑浊[6]。获得大量扩增的大肠杆菌E058菌液。

(责任编辑:qin)