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2.2 实验材料

斜面培养基：培养基组成为蛋白胨10 g/L，酵母粉g/L，NaCI 10 g/L，琼脂20 g/L。培养基灭菌30 min。

 种子培养基：采用YPD培养基，培养基组成为胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，灭菌115 ℃，30 min。

 发酵培养基：培养基组成为胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，50 ml三角瓶分装（量筒量取）后包扎灭菌。

 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯标准品，百灵威公司；蛋白胨、酵母膏、琼脂等常规试剂为市售生化试剂；其它试剂均为分析纯。

2.3实验方法

种子培养：从斜面培养基中挑取1接种环的菌落接种于装有100 mL种子培养基的500  mL三角瓶中，置于旋转式摇床 (37℃,180 r/min) 培养7 h。

发酵培养：接种液体培养基培养菌体。培养36 h后收集菌体，生理盐水清洗三遍后称取一定量湿菌做催化反应。

2.3.1 转化反应方法

取一定量的发酵液，离心分离得菌体，用生理盐水洗涤三次后将菌体悬浮于10 ml的50 mM PBS (磷酸盐缓冲液)中，加入10 g/L 6-氰基-3R-5R-二羟基己酸叔丁酯及5% （w/v）的葡萄糖，在30 ℃, 200 r/min下反应后，用等体积乙酸乙酯分三次萃取转化反应液，之后用色谱纯乙醇置换乙酸乙酯，过滤后分析检测产物量。

对于利用微生物整体细胞进行的生物催化反应，不同的反应条件会对细胞及参与反应的胞内还原酶的催化活性产生影响，考查了菌株在不同反应条件（温度、pH、体系）下不对称还原合成的情况，通过对反应条件的优化来进一步提高反应的产率。来!自-优.尔,论:文+网www.youerw.com

2.3.2 反应体系对菌株转化效率的影响

双水相体系(aqueous two-phase system,ATPS) 是指当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成了双水相系统。双水相在大多数情况下由水与非挥发性成分组成，因此避免了有机成分的挥发，一直来都被作为非至变性且温和的分离介质被应用于生物技术领域。双水相体系中生物转化和相分离的过程都可以更加温和地进行，在反应过程中底物和产物在双水相体系中会被重新分配，这样有效的降低了底物对产物的抑制作用。同时相较于传统的水-有机溶剂两相体系，由于组成双水相体系中的聚乙二醇（PEG）对生物分子的结构不但不会破坏还可以稳定生物大分子结构从而使得双水相体系不仅不会使生物活性物质变性、失活，对酶或细胞没有毒害作用。并且可以为生物转化反应提供温和的环境。而单独在有机溶剂体系中进行生物催化反应，有机溶剂会对微生物造成明显的毒害作用，破坏酶的结构的同时影响生物催化反应的进行。 羰基还原酶不对称还原6-氰基-3R-5R-二羟基己酸叔丁酯合成条件的优化(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_81165.html