本氏烟（Nicotiana benthamiana, Nb）是优质的植物病毒研究的一种模式植物。不仅大多数的植物病毒均极易感染本氏烟，而且它的生长周期比较短，植株较小容易栽培，具有良好的遗传转化和再生能力，所以，它是研究病原微生物与宿主之间的相互关系特别是研究免疫和防御信号的高级生物材料[15]。

第一章 材料与方法

1。1 试剂与材料

 1。1。1 种子与质粒

已构建的RDR6i，DRM2i，H3i干涉和H3-over expression过表达的转基因种子，ACMV-A（氨苄抗性）和ACMV-B（四环素抗性）病毒质粒均由实验室老师提供。

1。1。2 受体植物

生长在恒温（25℃）温室中的本氏烟（Nicotiana benthamiana)的野生型及转基因型植株，并且每天给予16 h光照以及8 h黑暗。

1。1。3 所需引物

ACMV-Pro-F: 5’- TGCGCACTAGCCACAACTTC-3’

ACMV-ORI-R: 5’- ATAAGTAGTGCGCGGGGACCAC-3’

ACMV_PRO-Xhol-R: 5’- AAGGCCTCTCGAGGTTGACCAAGTCAATT-3’

ACMV-AV1pro-F: 5’- CTCAACTAGAGACACTCTT-3’

ACMV-AV1pro -R: 5’- TTACGAGCCCTGATAACTGAGAC-3’

AC1Pst-F: 5’- 来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-CTGCAGTGCGCACTAGCCACAACTTC-3’

ACMV_PRO_SacI-R: 5’- 来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-GAGCTCGTTGACCAAGTCAATT-3’

Rep检测-F: 5’- ATGAGTACTCCTCGTTTTCG-3’

Rep检测-R: 5’- CGCCGGATGGCTCGCTTCTT-3’

NbEF1-F: 5’- TGCCTTGTGGAAGTTTGAGACC-3’

NbEF1-R: 5’- GGTGGAGTCAATAATCAGGACAGC-3’

NbGAPDH-F: 5’- AGCTGGTGCTGATTTCGTTGTG-3’

NbGAPDH-R: 5’- GAGCAGAGATCACAACCTTCTTGG-3’

 1。1。4 常见的缩写

本论文中常见的缩写及中英文对照见附录A。

 1。1。5 实验仪器

小型高速冷冻离心机（Eppendorf centrifuge 5424）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf centrifuge 5430）；真空离心浓缩仪（Concentrator plus）；恒温孵育器（Eppendorf ThermoStat plus）；PCR仪（BIO-RAD C1000 Thermal cycler）；实时PCR检测系统（CFX96）；自动凝胶成像系统（BIO-RAD GelDoc XR+Gel Imaging System）；细菌培养箱（美国Thermal公司）；天平（PL2002）；高通量组织研磨器（TissueLyser LT）；超净工作台（苏净）；生物安全柜（Thermal）。

1。2 实验的方法

 1。2。1 野生型本氏烟植株总DNA的提取

1) 使用TPS方法来提取植物总DNA。

2) 具体的实验操作步骤如下：

3) 样品选取约2-3 cm长度的本氏烟叶片，剪碎置于1。5 ML离心管中。

4) 在装有样品的1。5 ML离心管中加入500 l的TPS提取液和RNA酶约5 l，使用震碎机，使样品剧烈震荡混匀。

5) 将裂解后的离心管在65 ℃下水浴10分钟，水浴期间样品需混匀3次。

6) 加入氯仿异戊醇400l，震荡混匀。

7) 在室温下13000 rpm，离心10分钟，在提取上清液约300~400 l置于新的1。5 ML离心管中。

8) 向新的离心管中加入与上清液等体积的异丙醇和约30~50 l的醋酸钠，将离心管颠倒混匀，放于-4 ℃冰箱里静置20分钟。

9) 室温下13000 rpm，离心20分钟，弃上清悬浮沉淀，加入500 l的75%乙醇用于洗涤沉淀，洗涤2次。

10) DNA甲基化相关基因抗植物双生病毒研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_87938.html