11) 待酒精完全挥发后，管底呈透明后加入50 l的ddH2O，用于溶解DNA。

12) 用Nano Drop1000测定样品的DNA浓度。

1。2。2定量 PCR技术

1) 向96孔板中的每一个加样孔中加入5 l的SYBGreen反应液，0。5 l的上、下游引物和4 l的ddH2O。

2) 将96孔板放于漩涡仪下30 s，使体系充分混匀。

3) 4000 rpm，离心1 min。

4) 贴上膜，压平。

反应参数设置

T(℃) Duration

第一步 95 10 min

第二步 95 15 s

第三步 58 15 s

第四步 72 20 s

+Plate Read

第五步 GOTO 第二步

39  more times

第六步 Melt  Curve65 ℃ to 95 ℃，increment 0。5 ℃

For 5 s    +Plate Read

END

反应结束后，将PCR后的产物取5-10 l，进行电泳，检查扩增结果。

 1。2。3琼脂糖凝胶电泳

1) 配制胶液：使用天平称取1 g琼脂糖置于250 ml锥形瓶中，用量筒量取100 ml 1xTAE加入其中，为1 %的琼脂糖胶液；

2) 溶解：把胶液放入微波炉中高温加热使琼脂糖全部溶解，取出摇匀胶液；论文网

3) 胶板的制备：将溶解后的胶液进行冷却，并在冷却后约40-50 ℃的琼脂糖胶液中加入数滴Gel Red染料，混匀胶液然后倒入装好梳子的胶槽内，放置约20-30 min进行冷却；

4) 加样：先加入相对应的Marker，在按照顺序分别一一加入5-10 l的样品于样品槽中；

5) 电泳：恒电压190-220 V，电流控制在400 mA以上， 30 min电泳；

6) 观察和拍照：观察显示的电泳图，并保存。

1。2。4 病毒质粒的培养

1) 配制适量的LB培养基（常温下）待用；

2) 在提前紫外消毒过的超净工作台中，分别移取100 l的AMP（氨苄抗性）和TET（四环素抗性）置于两个培养基中；

3) 分别移取ACMV-A和ACMV-B病毒100 l于AMP培养基和TET培养基中；

4) 将两个培养基放于摇床中培养24 h；

5) 第二天取出待用于质粒的抽提；

 1。2。5 病毒质粒PCR

将采样后提取的基因组进行PCR扩增，按照如下的PCR，20 l体系进行加样。

2xMix 10 l

上游引物 1 l

下游引物 1l

DNA 1 l

ddH2O Upto 20 l

反应参数设置

T(℃) Duration Cycle

94 DNA甲基化相关基因抗植物双生病毒研究(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_87938.html