94 0。5 min

36

58 0。5 min

72 45 s

72 10 min 1

4 2 h storage

反应结束后，将PCR后的产物取5-10 l进行电泳检查，查看病毒基因组存在的情况。

1。2。6 热击转化法

1) 从-81 ℃的冰箱中取出分装好的感受态细胞置于冰上，待其缓慢冷却后取出连接产物10 µl或重组质粒0。5 l, 加入到50l体系中，冰浴30 min；

2) 然后金属浴42 ℃，热击1 min（为了让连接物能更有效进入到感受态细胞内），置于冰上5 min；

3) 加入置于金属浴中42 ℃带有无抗性的LB培养基；

4) 置于37 ℃的摇床约1 h；

5) 4000 rpm离心5 min；

6) 在提前紫外消毒过的超净工作台中，将已离心过的LB培养基去掉上液，留下约100 l的底部沉淀，进行反复吹打，涂布在含有相应抗性的LB培养基上，用封口膜进行封口；

7) 37 ℃的培养箱中倒置培养过夜，24 h后取出。

8) 将长出的菌用移液枪的枪头吸取到新的液体培养基中进行培养。

1。2。7 质粒抽提

     质粒较小，速度较快则选择试剂盒的提取法

1) 将带有目的质粒的菌液，4000 rpm离心15 min，弃上清，收集菌体；

2) 加入250 l的BufferP1(已加入RNaseA)，用涡旋仪使沉淀彻底重新悬浮混匀，转入新的1。5 ML离心管中；

3) 加入250 l的BufferP2，温和的上下翻转4-6次，使菌液充分裂解混合，直至形成透明的溶液。此步骤反应时间不宜超过5 min；

4) 加入350 l的BufferP3，立即温和的上下翻转6-7次，出现白色沉淀后，13000 rpm离心5 min，立即取出并且上下混匀，1300 rpm再离心5 min；

5) 取出离心后的上清至硅胶吸附柱AC中，1300 rpm离心1 min，再重复一次；文献综述

6) 倒废液，500 l的PE洗脱液（带有乙醇），1200 rpm离心1 min；

7) 倒出废液，250 l的PE洗脱液（带有乙醇），1200 rpm离心1 min；

8) 弃废液，13000 rpm空离2 min；

9) 将吸附柱AC置于新的1。5 ML的离心管中，悬空加入100l的BufferEB至吸附柱中，室温下静置2 min；

10) 12000 rpm离心1 min洗脱，加入100l的ddH2O

11) 12000 rpm离心1 min，弃柱，测浓度。

第二章植株的培育和处理过程

3。1 转基因的本氏烟草植株的播种及移苗

1) 土壤的制备及分装

2) 均匀的播撒种子，并插好标签；

3) 用保鲜膜封好盆栽，等到种子萌发再开口；

4) 观察到植株的叶子长到有约玉米粒的大小时，准备移苗； DNA甲基化相关基因抗植物双生病毒研究(5):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_87938.html