1。4 多聚组氨酸/strep II二元亲和标签融合表达系统

依据氨基酸之间在物理性质（如大小）和化学性质（如所带电荷的正负、与特定物质的结合）上的差异，人们建立了多种分离纯化氨基酸的方法，其中层析法是一种主要的蛋白质分离纯化技术。当待分离样品随着流动相通过固定相时，样品中各组分的理化性质差异使得各自与固定相发生相互作用（如溶解、结合、吸附等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同。在种类繁多的层析方法中，亲和层析又是更为广泛应用的一种分离纯化技术。其基本原理是基于蛋白质和特异性配体之间的特异的高亲和性的非共价结合，从而实现分离的一类特殊层析技术。在本文中，通过在目的蛋白的C末端添加多聚组氨酸（10×His-tag）/strep II二元亲和标签，不但能提高目的蛋白表达水平，表达出His-tag/strep II融合蛋白后，还能简化后续蛋白的分离纯化过程。利用组氨酸与金属镍离子之间的特异性相互作用，使目的蛋白结合在镍离子亲和层析柱上，而其它杂蛋白则直接从柱中流出，达到分离目的，随后加入另一种可溶性配体使之与原来固定相中的配体竞争目的蛋白从而将目的蛋白洗脱并收集。该方法被称为固定化金属离子亲和层析，由于该方法具有配体简单、亲和性强、条件温和等优点，目前在蛋白分离纯化工程上得到了广泛的使用。同时又由于添加的His-tag几乎不会对蛋白质的结构、理化特性以及生物学功能造成影响，适用范围广，故本文选择添加10×His-tag纯化标签构建了多聚组氨酸标签表达载体。

1。5 本课题拟研究内容

本课题通过构建cmr3的二元亲和标签融合表达载体，在嗜热古细菌Sulfolobus中建立CMR复合物亚基cmr3的过度表达方法，进一步实现Sulfolobus CMR 复合物的纯化，通过运用非变性质谱方法探究其亚基组成以及相互作用关系，可以进一步获得CMR复合物的结构信息，从而为其细胞功能的研究提供线索。

本课题所要解决的具体问题如下：来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-

1。 建立嗜热古细菌Sulfolobus的固体培养，液体培养，保种，转化等分子生物学方法；

2。建立嗜热古细菌Sulfolobus基因组DNA的纯化方法，实现对于特定目标基因的扩增；

3。构建可以在大肠杆菌中和嗜热古细菌中的过度表达结构，实现目标蛋白的过度表达；

4。对于目标蛋白及其复合物进行纯化。

1。6 本课题研究思路

一直以来的研究显示，CRISPR-Cas系统中的类型III系统相对于其它的CRISPR-Cas系统是独特的，因为它识别并作用于RNA而非DNA。而最近又有新的研究发现，CMR复合物在冰岛硫化叶菌中被编码后，也会以DNA为目标进行清除[17]，这对其作用机制又提出了新的思考。故本课题选择以冰岛硫化叶菌为宿主菌，表达出cmr3亚基以及CMR复合物，并进行结构上的研究分析，以期对其功能做进一步的阐释。

开展该课题首先要在本实验室建立冰岛硫化叶菌的固体培养，液体培养，保种，基因组提取等分子生物学方法，这是进行下一步研究的基础。然后提取冰岛硫化叶菌的基因组作为模板，设计引物，扩增cmr3目标序列，通过三步克隆操作在目标片段C端添加10×His tag/strep II二元亲和标签，构建pSeSD-His-cmr3融合表达载体，通过电转化的方法将表达载体导入到宿主菌E233S中进行表达，最后分离纯化出目标蛋白，进行结构及功能研究。