3。4。3 pH稳定性 19

4 结论 20

参考文献 22

致谢 23

附录1：本研究所涉及的基因与引物序列 24

1 绪论

在工业化生产中，简单、经济、有成本效益的方法一直被迫切需要着。催化反应可以简化工艺流程、降低能耗、节省资源、减少污染，不失为一种不错的生产方式。而在催化反应中，酶催化反应用一种具体有效和立体选择的方式，与常规化学催化剂相比，拥有更大的发展空间。在不对称合成中，运用生物催化剂进行反应，反应条件温和，过程简单、环保，产物有光学活性且纯度高，是近年来国内外生物催化剂研究的热点[1]。

1。1 羟基腈裂解酶来自优Q尔W论E文R网wWw.YouERw.com 加QQ75201.8766

羟基腈裂解酶又称为醇腈酶，广泛存在于高等植物中，如亚麻(Linum usitatissimum hydroxynitrile lyase，LuHNL)、橡胶树(Hevea brasiliensis hydroxynitrile lyase，HbHNL)、木薯(Manihot esculenta hydroxynitrile lyase，MeHNL)、拟南芥（Arabidopsis thaliana hydroxynitrile lyase，AtHNL）等[2]。羟基腈裂解酶能可逆地催化氰和醛或酮类化合物的反应，生成手性氰醇合物，是植物对抗动物和真菌侵袭的有力武器。如图1所示，其产物手性氰醇不仅是一类重要的有机中间体，还是合成α-羟基酸、α-羟基酯、α-羟基酮和β-羟基胺等光学活性医药、农药中间体的基础[3，4]。近年来羟基腈裂解酶被广泛应用于手性氰醇的合成，成为国内外研究的热点[5]。

R1 = H，R2 = aplipHatic (un)saturated aldehydes， (un)saturated benzaldehydes， heteroaromatic aldehydes; R1 ≠ H，R2 = methyl-， ethyl-， pHenyl- and heterocyclic ketones， cyclo-hexanones

图1 氰醇的合成及其在化学合成中的应用论文网

1837年，Friedrich Wohler首次在杏仁中发现活性HNLs，被称为苦杏仁腈酶。迄今为止，已经证实体内含有HNL的植物有3000多种，已经报道的羟基腈裂解酶的来源有15种[6，7]。尽管HNL在自然界中的分布十分的广泛，但从自然界中直接获得的羟基腈裂解酶不仅产率低而且难以纯化，这就限制了羟基腈裂解酶的使用。为了解决这个难题，王丹等研究人员利用基因工程技术， 将编码木薯HNLcDNA克隆到原核表达载体pBV220上， 构建了重组质粒pBV220-HNL，实现了木薯HNL在大肠杆菌中的初步表达，检测到的酶活力最高达到5。460U·mL-1，这为酶的高效表达提供了思路[8]。

虽然大自然中存在各种各样的酶，但是由于天然酶自身的不稳定性以及工业化生产中复杂、苛刻的反应条件，以至于天然酶难以直接应用于工业生产[9]。这就需要运用酶的定向改造技术，提高酶的稳定性，扩大酶的使用范围，提高时空收益率[10]。

1。2 酶的定向改造技术

酶分子的定向进化属于蛋白质的非理性设计。它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊条件，模拟自然进化机制（突变、重组），在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶，是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径[9，11]。

目前运用酶的定向改造技术已经取得许多成果。这些成果主要体现在提高酶活性、稳定性上，使酶能够适应恶劣的人工环境，甚至还可以创造新的酶活性、改变对应异构体特异性等。如Wang等人通过定向进化的方法改良L-天冬氨酸酶，使得到的优化突变体活性提高了28 倍；Song和Rhee利用随机突变和基因重组的方法，筛选出了可以在有机溶剂的条件下高效催化的三株磷脂酶A1突变体[11]。随着酶的定向改造技术的发展，酶在实验研究、工业生产上的应用越来越广泛。