1。3 活性包涵体(CatIBs)

包涵体（Inclusion bodies, IBs）是指外源基因在原核细胞中表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。在传统观念里，包涵体是错误折叠的蛋白聚集体，只能被用作体外重折叠和回收的蛋白质来源[12-15]。但近年的研究发现，某些包涵体存在正确折叠的蛋白质组分，具有生物催化活性，这一发现引发了学者对于活性包涵体的研究热潮[13,14]。与可溶性蛋白质相比，活性包涵体易于纯化、分离，稳定性高，可重复多次使用，被认为是工业和生物医学应用中的理想生物材料[12，15]。

近年来，生物活性包涵体（catalytically-active inclusion bodies, CatIBs）受到的关注越来越多。目前，已经报道了几种诱导活性包涵体形成的几种融合蛋白质搭配，如口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1，人b-淀粉样蛋白肽Ab42，麦芽糖结合蛋白突变体，嗜纤维杆菌纤维素结合结构域 ，和离子自组装肽ELK16。且研究表明，数种蛋白质包括绿色荧光蛋白，β-半乳糖苷，β-内酰胺酶，碱性磷酸酶，D-氨基酸氧化酶，多磷酸激酶3，麦芽糊精磷酸化酶，唾液酸醛缩酶等和上述融合蛋白质搭配时，已经成功产生活性包涵体。活性包涵体在酶生产和工业应用中具有许多引人注目的优势，因此开发出能产生高纯度、高稳定性的活性包涵体的简单经济的生产方法至关重要。

1。4 反应条件对酶的影响

在生物催化过程中，反应条件直接决定催化过程的成败。影响酶活性的因素很多，其中反应温度和pH值尤为关键。在较高温度和过酸或过碱条件下，酶都有失活的危险，这就需要研究酶在不同温度和不同pH条件下的稳定性，了解酶的适用范围，确保酶的正常使用。

1。4。1 温度的影响

温度是酶反应中的重要参数[16]。酶要在一定温度条件下才能发挥其催化作用。在低温下，虽然能够保留酶的活性，但是催化活性丧失。随着温度升高，酶催化反应的速率升高，但同时，酶的活性也加速丧失，当达到一定温度时，酶的空间结构破坏，活性丧失。文献综述

1。4。2 pH值的影响

pH值直接影响酶与底物的结合状态，从而影响酶的活性[16]。在最适pH条件下，酶最易和底物结合；当pH值偏高或偏低时，酶的活动中心的带电性质改变，酶与底物的结合能力降低；当pH过高或过低时，酶的空间结构被破坏，活性消失。

1。5 本论文研究内容

本文通过基因融合表达策略，使用三种具有良好限定的四级卷曲螺旋结构域作为融合配偶体，选择拟南芥羟基腈裂解酶（AtHNL）作为融合对象构建重组质粒，在大肠杆菌细胞中表达产生活性包涵体，而后通过在不同温度和pH值下，测定重组酶的活性，考察突变酶的热稳定性和pH稳定性，如图2所示。通过实验发现，经定向改造后的得到的重组1USE-AtHNL和1Y66-AtHNL的酶产物以活性包涵体（CatIBs）的形式存在，热稳定性和pH稳定性得到了明显的提升；而重组1YBK-AtHNL的酶产物以可溶性蛋白的形式存在，热稳定性和pH稳定性均降低。