肝素的抗凝作用主要是由抗凝血酶III介导实现的[5-7]。肝素链中存在一种特异戊糖序列，它与抗凝血酶III(Antithrombin III，AT III)特异结合，活化AT III，抑制凝血X因子活化形式FXa，从而发挥抗凝血作用[8]。这一过程已经经过核磁共振光谱和X结晶衍射得到了证明，其中戊糖序列中的硫酸基和羧基在与AT III结合的过程中发挥着重要作用[9-10]。抗凝血酶(AT III)是一单链糖蛋白，相对分子质量为58.2kD，血浆浓度为2μmol/L，由9个a－螺旋结构、3个β折叠、1个反应中心环共同组成。在肝素存在下，AT III的抗凝作用可以增加数千倍。

特定的蛋白质检测和成像，在医疗诊断以及在生物学研究细胞过程中都是一种非常重要的检测蛋白质生物标记物的方法。目前大多数小分子荧光的探针是用于监测酶活性的[11]，它们的荧光开启机制是通过化学探测器将反应产物转化成荧光产物[12-15]。但是，对于非酶蛋白荧光探针的设计仍然是一项具有挑战性的任务。文献综述

图1 AT III的分子结构

我们拟通过合成一种非极性下的荧光探针，来用于对肝素的检测。如图1，精氨酸393 - 丝氨酸394位于在分子的表面上的暴露的环。这个环被称为反应位点环或反应中心环。我们合成一种非极性下的荧光探针后，将该探针连接到反应中心环上，在有肝素存在的情况下，该荧光染料会进入到蛋白内部非极性环境，荧光强度增强，从而利用荧光强度对肝素进行定量分析。

2、实验部分

2.1实验试剂

C7H10N2O2S•HCI（梯希爱化成工业有限公司，AR）、抗凝血酶Ⅲ（25 mg 50 Mm, TRIS; 0.15 M NaCl, PH=7.4）、三乙胺（梯希爱化成工业有限公司，AR）、牛凝血酶、肝素（Heparin 150U/mg, Biosharp, 合肥）、N，N-二甲基甲酰胺（西陇化工股份有限公司，AR）。

2.2实验仪器

玻璃仪器：5 mL烧杯、分液漏斗、玻璃棒、锥形瓶。

检测仪器：TU-1901紫外分析仪(中国，北京，普析通用仪器有限责任公司）、Bruker Avance DPX-400 MHz型核磁共振仪、F-4600荧光分析仪（Hitachi High-Tech Science corporation)、FTIR-tensor-27型红外光谱仪(KBr压片 美国大力神）。

其它仪器：电子天平（梅特勒-托力仪器（上海）有限公司)、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）、移液枪 (Eppendorf, 2.5 L,10 L, 100 L, 1000 L德国)、布氏漏斗。

2.3实验过程

2.3.1探针的合成

反应原理 [16]

将DBD-F、C7H10N2O2S、在DMF与TEA的存在下反应2 h。

实验步骤

第一次实验

按文献反应物的质量缩小10倍称取各反应物。称取2.226 mg DBD-F、3.145 mg C7H10N2O2S•HCI、3.859 L 三乙胺（注意需在通风橱加入三乙胺）和0.15 mL DMF，将它们依次放至5mL烧杯（呈有小磁子）里，然后放入水浴锅（温度为18摄氏度）中，用保鲜膜封上小烧杯口。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

反应两个小时后，小烧杯中呈现亮黄色，与之前对比颜色较亮，初步推测该产物具有荧光性。加入二次去离子水后溶液出现浑浊，有沉淀析出。用蒸馏水洗涤抽滤，洗抽滤完成后放入烘箱中以60摄氏度烘干2小时。

烘干后将产物点板。点板时展开剂为：丙酮和石油醚为1:1.5。用丙酮溶解DBD-F、三乙胺，用DMF溶解C7H10N2O2S•HCI（因为其极性大）。点板后发现有较强的荧光性，说明有我们所需要的染料生成。但由于产物太少，测了氢谱，氢谱不明显。但可以确定此方法可行。

第二次实验

这次实验吸取上次实验教训，扩大反应物的用量，称取22.46 mg DBD-F、30.09 mg C7H10N2O2S•HCI、1.5 mL DMF 和38.01 L 三乙胺，加入已将放好小磁子的小烧杯中。将反应的小烧杯放入水浴锅（温度为18摄氏度）反应，用保鲜膜封上小烧杯口。