酵母Fes1蛋白与氧化应激的关系(2)
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species,RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素，酵母细胞具有很强的应激反应能力"当它受到光热化学损伤等不良刺激时"很快就会合成许多具有自我修复性的保护性物质"以抵御这些不良的条件)在所有的氧化应激反应中"研究得最深入的是酿酒酵母对过氧化氢和超氧化物的应激反应[2]。利用酵母的应激反应"在人为控制的损伤条件下刺激活的酵母细胞"使其产生保护性物质"经过提取可得到活性酵母衍生物它能提高胶原蛋白和弹性蛋白的形成能力，在制药业和化妆品工业中有着极为广泛的应用[1]。
本文主要研究氧化刺激对酵母Fes1蛋白表达的影响，对于更加深入了解及研究人体内的氧化应激反应具有重要意义，进而推动有关氧化的疾病的研究及治疗。
1. 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株
本实验所用的材料是安琪酵母，其他实验药品均来自周口师范学院生命科学系分子生物学实验室。
1.1.2培养基和缓冲液
初筛（复筛）选培养基(定容至 500 mL )：
成分 质量/g
酵母膏 5
蛋白胨 10
琼脂粉 10
葡萄糖 10
扩大培养基(定容至 300 mL )：
成分 质量/g
酵母膏 3
蛋白胨 6
葡萄糖 6
破壁缓冲液：0.1 mol/L 磷酸缓冲液（Ph 7.4）。称取NaH2PO4 3.12g 溶于100mL 水中；称取 Na2HPO4 35.8g 溶于500mL 水中；取95mL NaH2PO4 溶液，405mL Na2HPO4溶液混合在一起，定容至1000mL，4℃冰箱保存。
凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g ,亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8 g，加重蒸水至100mL。外包锡纸 4℃ 冰箱保存，30 天以内使用。
Tris-HCL分离胶缓冲液(1.5mol/L，pH 8.8): 18.15 g Tris, 加约 80 mL重蒸水,用 1 moL/L HCL 调 pH 到 8.8,用重蒸水稀释至最终体积为100 mL ,4 ℃ 冰箱保存。
Tris-HCL浓缩胶缓冲液(0.5 moL/L，pH6.8 ): 6 g Tris，加约60 mL 重蒸水，用1 moL/L HCL 调 pH 到6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100 mL ,4 ℃ 冰箱保存。
10% SDS（十二烷基磺酸钠）室温保存。10 g SDS溶解在100 g 水中在37 ℃下水浴 1 h 进行溶解。
2倍还原缓冲液：
成分 体积 / mL
0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8 2.5
甘油 2.0
质量浓度10%SDS 4.0
质量浓度0.1%溴酚蓝 0.5
β-巯基乙醇 1.0
总体积 10
电极缓冲液(定容至 1000 mL，pH 8.3，4℃ 冰箱保存 )：
成分 质量 / g
Tris 3
甘氨酸 14.4
SDS 1.0
根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验采用12%的分离胶：
成分 体积
重蒸水 3.35 mL
1.5moL/L Tris-HCL(pH 8.8) 2.5 mL
质量浓度为10%SDS 0.1 mL
凝胶贮备液(Acr/Bis) 4.0 mL
质量浓度为 10% 硫酸铵 50 μL
TEMED 5 μL
总体积 10 mL