拟南芥LysM受体样激酶的克隆与筛库载体的构建(3)
PCR反应体系：cDNA 2μL，上下游引物各1.5μL，dNTP 2μL，LA TaqDNA聚合酶酶0.5μL，加去离子水至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，52℃退火45sec，72℃延伸130sec，32个循环；72℃再延伸10min。取样品4μL进行琼脂糖电泳，观察电泳结果，经柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。
1.2.3 质粒pMD18-T与目的片段LysM的连接
目的基因片段与载体pMD18-T的连接按照pMD18-T载体(TaKaRa)说明书操作。将pMD18-T-LysM克隆载体转化大肠杆菌感受态，按照TransB(DE3) Chemically Competent Cell(北京全式金)说明书操作。涂布转化菌体于含氨苄霉素的LB固体培养基，挑取阳性克隆菌，用含氨苄霉素的LB液体培养基扩大培养。提取质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.4 pMD18-T-LysM重组质粒和pGBKT7质粒的双酶切与纯化回收
提取并纯化pMD18-T-LysM重组载体和pGBKT7载体，限制性内切酶SalⅠ和NdeⅠ处理。双酶切体系：SalⅠ和NdeⅠ各1μL，10×H Buffer 2μL，载体16μL；37℃，1h。取反应液5μL琼脂糖凝胶电泳验证双酶切效果。切胶回收目的片段，-20℃保存。
1.2.5 目的片段LysM与pGBKT7片段的连接
连接体系：LysM基因7μL，pGBKT7质粒1μL，T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA buffer 1μL，去离子水 1μL；16℃过夜。
1.2.6 重组载体pGBKT7-LysM的转化与阳性克隆的挑取
将pGBKT7-LysM重组载体转化感受态细胞。涂布菌体于含卡那霉素的LB固体培养基，挑取阳性克隆菌，用含卡那霉素的LB液体培养基扩大培养并提取质粒。
1.2.7 重组载体pGBKT7-LysM的电泳分析
电泳检测重组载体和空载体，分析两者大小。
1.2.8 重组载体pGBKT7-LysM的PCR鉴定
分别以重组质粒和空质粒为模板进行PCR反应，所用引物及PCR条件同2.2.1，电泳检测PCR产物。
1.2.9 双酶切处理重组质粒pGBKT7-LysM检测
SalⅠ和NdeⅠ双酶切处理重组质粒，条件同2.3.1，电泳检测酶切结果。
1.2.10 重组载体pGBKT7-LysM的测序鉴定
以pGBKT7载体的通用引物为测序引物，将重组质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
2. 结果与分析
2.1 拟南芥叶片RNA的提取及目的基因的检测
如图3所示，用拟南芥叶片材料提取其总RNA，得到质量较高的RNA。以总RNA为模板进行反转录RT-PCR，再以LysM的特异引物进行PCR扩增目的基因，得到如图4所示的一条带，其中1、2为1854bp的LysM的目的片段。
图3 拟南芥叶片总RNA
图4 LysM PCR产物电泳结果
注：M：DL 5000 Marker；1、2为LysM PCR产物
2.2 pMD18-T-LysM重组质粒与pGBKT7载体的双酶切检测
双酶切反应将目的基因从pMD18-T-LysM重组质粒上切下来，琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，如图5所示双酶切后的pMD18-T-LysM重组载体分为两条带，条带2约1854bp，条带1大于2000bp，切胶回收条带2。双酶切后的线性pGBKT7比环状质粒更靠近加样孔。如图6所示2为环状载体，1为线状载体。切胶回收条带1。
图5 pMD18-T-LysM双酶切
注：M：DL 5000 Marker；2为1854bp目的片段；1为酶切后的线性T载体
图6 pGBKT7载体的双酶切
注：M：DL 5000 Marker；2为未经酶切处理的pGBKT7载体；1为双酶切后的pGBKT7载体
2.3 重组质粒pGBKT7-LysM琼脂糖电泳比较大小检测结果
目的片段LysM全长为1854bp，空载体为7.3kb，空载体的两个酶切位点之间相差不到30个碱基对，这样相差1800bp左右的两个质粒通过琼脂糖凝胶电泳图可以检测，重组载体要比空载体靠近加样孔。如图7条带1为重组载体，核酸碱基对数大约为7.5 kb显然要比条带2空载体更靠近加样孔。初步说明目的片段构建到pGBKT7载体上。
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