拟南芥LysM受体样激酶的克隆与筛库载体的构建(4)
图7 重组质粒与空质粒的电泳比较
注：M: DL 5000 Marker;1为重组质粒；2为空质粒
2.4 重组质粒pGBKT7-LysM的PCR检测结果
分别提取重组质粒和空质粒pGBKT7，以之为模板进行PCR扩增。如图8以LysM的特异引物扩增出约1854bp的条带，而空质粒均未扩增出任何条带。进一步证明pGBKT7-LysM重组质粒构建成功。
图8重组质粒PCR产物结果
注：M: DL 5000 Marker；1：以空质粒为模版；2：以重组质粒为模版
2.5 重组质粒pGBKT7-LysM双酶切电泳结果
双酶切处理重组质粒，质粒由环状核酸链变为两条大小不同的线状核酸链，如图9所示，其中一条带约为7.3kp的线状pGBKT7，另一条带约为1854bp的LysM片段。
图9 重组质粒双酶切电泳结果
注：M：DL 5000 Marker；a、b、c均为双酶切处理的重组载体
2.6 重组质粒pGBKT7-LysM测序结果
将重组的阳性质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，双向测序结果表明目的基因LysM成功插入pGBKT7载体，包括完整的ORF，说明筛库载体构建准确无误(如图10)。
图10 重组阳性质粒的部分测序结果
3. 讨论
植物在长时间的进化过程中逐步形成了一套独有的天然免疫系统，当病原菌侵染植物体时，在侵染点会发生过敏反应(Hypersensitive Response, HR)，病原菌入侵信号传至整个植物体，这样植物便产生了获得性抗性(Systemic Acquired Resistance, SAR)[10]。植物的PAMP防御机制需要植物细胞表面的模式识别受体与病原分子的相互作用，这种通过受体识别而诱导的防御模式是植物免疫的最基本过程，它被定义为植物的基础抗性[11](basal disease resistance)。有研究表明如果植物拥有某种识别受体，即使PAMP的处理浓度在纳摩尔以下，植物也能感知相应微生物的PAMPs，这说明植物模式识别受体具有专化性和高灵敏性的特点，相反，植物体若缺乏某种模式受体，那么它就不能识别相应的病原微生物[4]。其中，真菌的几丁质在诱导拟南芥抗性产生过程中起着至关重要的作用[12]。
几丁质通过与植物细胞表面的受体样激酶RLK相互作用引起植物对真菌的防御应答，许多学者都将这一点作为研究植物基础抗性的切入点[13-15]。拟南芥细胞表面的PRR有许多种，其中拟南芥的LysM受体样激酶就能够特异性识别几丁质，使植物获得对几丁质真菌的抗性，但具体的作用机理尚不明确[16]。为进一步研究几丁质与LysM RLK互作机理。本实验通过构建筛库载体pGBKT7-LysM试图在后续实验中发现更多与LysM基因相互作用的基因。
pGBKT7载体是一种经典的酵母双杂交的诱饵载体，它是真核表达载体，能够在酵母细胞中高效表达，高效的表达源于载体本身所携带的ADH1启动子以及T7和ADH1终止信号，这对于真核基因功能的研究起着重要作用。正确的思路和合适的研究材料是实验顺利进展的关键，但也少不了对各种反应体系和反应条件的准确把握。
在保证引物设计恰当的前提下，对于退火温度的选择就显得尤为重要。在PCR过程中，如果退火温度过高，则有可能无法克隆出目的片段；如果过低，则增加了非特异性条带出现的几率。通常退火温度要低于引物TM值3-5℃，最适退火温度可以通过设定某个范围内的温度梯度来确定。同样，双酶切的最适酶切时间也可以通过设定时间梯度来确定。酶切时间会直接影响酶切反应的酶切结果的质量和酶切的效率，双酶切时间过长有可能将目的片段切断；时间过短有可能酶切不完全，这就影响了酶切的效率。
另外，如何检测酶切结果的质量也是非常重要的，就本实验而言，目的片段LysM的酶切位点位于片段两端，酶切后的非目的片段小于10bp，这就不能很好的在电泳图片上显示出来。因此我们将目的片段LysM先构建在T载体上，然后再双酶切处理pMD18-T-LysM重组载体(图5)，T载体本身的碱基对数量足以在电泳图片上显现，这样只要电泳图片上显示的是两条带且两条条带分居Maker 2000bp标度两侧，这样我们就可以从宏观上判断酶切的质量与效率。对于pGBKT7而言，两个酶切位点之间仅含有28个碱基对，这种酶切的非目的片段不足以影响本身是7.3kp的载体。同样大小的载体，线状质粒的电泳速率要低于环状质粒，两种型态的质粒可以从电泳图片上清楚的显示出来，我们可以通过电泳图片来判断酶切的结果，这样就保证了载体构建的稳定性与连续性。本实验提取阳性克隆质粒，通过重组质粒PCR、双酶切验证以及电泳比较三种方法检测构建效果，从不同方面确保质粒构建的准确性，最后经测序鉴定，本实验成功构建了筛库载体pGBKT7-LysM。
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