AHL分子荧光法检测质粒的构建(11)
3．实验结果与讨论
3.1 质粒抽提
图3-1 质粒抽提结果
Fig 3-1 The results of the extraction of plasmids
注：从右往左，第1条泳道为Marker（λDNA-HindⅢ酶切产生的Marker-S），第2~4条泳道为菌株117的质粒（2907bp），第5~8条泳道为菌株126的质粒（3317bp）。图中可观察到7组加样的条带均在齐质粒长度的对应位置，抽提成功。
3.2绿色荧光蛋白GFP的扩增
图3-2 PCR产物的验证
Fig 3-2 the products of PCR
注：从右往左，第1条泳道为Marker（250bp-II DNA ladder），第2~7条泳道为GFP1~GFP6。图中可观察到6组PCR产物的条带均在1500bp左右，因此GFP片段的PCR扩增成功。
3.3目的基因与载体质粒的酶切
3.3.1 目的基因GFP的酶切
图3-3 GFP酶切结果
Fig 3-3 The results of digestion
注：从左往右，第2条泳道为Marker（250bp DNA Marker plus），第4条泳道为AatⅡ切割后的GFP扩增产物。图中可见，酶切后产生1050bp和450bp两个条带，我们所需要的GFP片段为1050bp。
3.3.2 对1050bp处的条带进行割胶回收，并再次电泳验证回收结果
图3-4 GFP回收结果
Fig 3-4 The results of recovery
注：从左往右，第2条泳道为Marker（250bp DNA Marker plus），第3条泳道为回收后的GPF片段（1050bp）。图中的条带在1050bp位置，回收成功。
3.3.3载体质粒PLuxR的酶切
图3-5 pLuxR酶切结果
Fig 3-5 The results of digestion
注：从右往左，第一条泳道为Marker（250bp-II DNA ladder），第3条泳道为用AatⅡ切割后的pLuxR质粒，第4条泳道为未酶切的环形pLuxR质粒。
3.3.4 pLuxR的去磷酸化处理
图3-6 Alkaline Phosphatase处理后的pLuxR
Fig 3-6 The results of dephosphorylation
注：从左往右，第2条泳道为（250bp-II DNA ladder），第4条泳道为Alkaline Phosphatase处理后的pLuxR。质粒pLuxR的长度为3317bp，被线形化的质粒与环形质粒在长度上应有肉眼明显可见的差别。图中条带位置符合被线形化的pLuxR的长度，且明显没有其它条带，说明去磷酸化反应比较完全。
图3-7 质粒pLuxR的回收结果
Fig 3-7 The results of the recovery of plasmid pLuxR
注：从左往右，第2条泳道为（250bp-II DNA ladder），第3条泳道为Alkaline Phosphatase处理后的pLuxR（3317bp）。图中条带位置符合去磷酸化处理后的pLuxR长度，回收成功。
3.4重组质粒的构建和转化
3.4.1 重组质粒的拼接
图3-8 重组质粒拼接结果
Fig 3-8 The results of ligastion
注：从左往右，第2条泳道为Marker（250bp DNA Marker plus），第4条泳道为重组质粒。重组质粒的长度应为4372bp，由于环状质粒在琼脂糖凝胶电泳中跑出的长度会比其实际长度短一些，而上图中的条带在4000bp左右的位置，因此我们初步断定此重组质粒拼接成功。
图3-9 重组质粒回收结果
Fig 3-9 The results of the recovery of the recombinant plasmid
注：从左往右，第2条泳道为Marker（250bp DNA Marker plus），第3条泳道为回收到的重组质粒。该条带符合重组质粒的长度，回收成功。
以下为重组质粒的图谱，我们将该质粒命名为pLuxR-GFPuv2。
图3-10 重组质粒的图谱
Fig 3-10 Gene map of the recombinant plasmid
3.4.2 转化DH5α和Top10F’感受态细菌
4块转化菌平板上菌长出边缘光滑的圆形小菌落，下表为该4平板孵育12~17小时中每个阶段的颜色和大小。
表3-1.转化结果
Table 3-1 The results of transformation
平 板
重组质粒导入DH5α
（Kan） 重组质粒导入DH5α