AHL分子荧光法检测质粒的构建(12)
（Kan，IPTG） 重组质粒导入Top10F’ （Kan） 重组质粒导入Top10F’ （Kan，IPTG）
时 间 颜色 直径 颜色 直径 颜色 直径 颜色 直径
12h 米白 0.5mm 米白 0.5mm 米白 0.5mm 米白 0.5mm
13h 米白 0.5mm 米白 0.5mm 米白 0.5mm 米白 0.5mm
14h 米白 0.7mm 米白 0.6mm 米白 0.7mm 米白 0.6mm
15h 米白 0.8mm 米黄 0.6mm 米白 0.8mm 米黄 0.6mm
16h 米白 1.0mm 黄 0.7mm 米白 1.0mm 黄 0.7mm
17h 米白 1.2mm 黄绿 0.8mm 米白 1.2mm 黄绿 0.8mm
上表显示，平板中只加了卡那霉素的DH5α和Top10F’转化菌，在生长12~17小时中的颜色都为米白色，且菌落慢慢长大，该现象符合预期中转化菌在无AHL环境中的生长情况；平板中同时加有卡那霉素和IPTG的DH5α和Top10F’转化菌，其菌落颜色都在12~14小时呈米白而15小时后开始渐渐变为米黄色，16小时观察其颜色为黄色，17小时其颜色呈黄绿色，菌落慢慢增大但其生长速度较前者较小。
图3-11 Top10F’（Kan）和Top10F’（Kan，IPTG）
Fig 3-11 Top10F’（Kan）and Top10F’（Kan，IPTG）
在紫外灯的照射下，Top10F’（Kan）中长出的菌落外观与普通的大肠杆菌一样，而Top10F’（Kan，IPTG）中的菌落有明显的荧光。
以上结果显示，平板中同时加有卡那霉素和IPTG的DH5α和Top10F’转化菌，在环境中没有AHL的情况下产出荧光且随时间的增加颜色越来越深，这一现象并不符合我们所要构建的biosensor的特性。
原因分析：
有研究表明，细菌在营养贫乏的条件下，R蛋白也能被激活。在转化菌的生长过程中，IPTG诱导了Lac启动子的启动，luxR基因表达产出R蛋白。细菌生长12~14小时时，培养基中的营养足够细菌的生长，R蛋白未被激活，而当细菌生长15个小时后培养基中的营养逐渐耗尽，由于营养贫乏，R蛋白被激活。被激活后的R蛋白与promoter结合，promoter被启动，最终导致GFP基因的表达。
3.5重组质粒的验证和筛选
图3-12 目的基因插入方向的验证
Fig 3-12 The test of the direction of the target genes
注：从左往右，第1条泳道为Marker（λDNA-HindⅢ酶切产生的Marker-S），第2~8条泳道为PCR产物。图中可见PCR产物的每条泳道上都有明显的条带，此6个质粒中没有目的基因插入方向正确的质粒。
经过多次反复实验，未能从转化菌中筛选出目的基因插入方向正确的质粒，该结果目前还不能分析其具体原因，可能的原因是重组质粒的拼接不正确，需再次验证每一步实验产物的正确性，重新拼接质粒。
4．结论
本实验利用质粒pLuxR和pLuxGFPuv2构建含有GFP基因的重组质粒并转化宿主细菌，欲构建一biosensor，检测环境中的AHL信号分子是否达到值域。实验结果显示，转化菌能在IPTG的诱导下产生荧光，说明GFP基因被成功插入到载体质粒上，但经多次反复实验始终未能筛选出GFP基因插入方向正确的重组质粒，可能是重组质粒的拼接不正确。在本实验室的条件下，利用基因测序来检测重组质粒是否正确不可行，无法得知重组质粒正确与否。因此，虽然该重组质粒转化的宿主菌能在IPTG的诱导下产生荧光，其能否成为biosensor尚待进一步实验验证。由于毕业设计实验的时间有限，所以该假设无法继续通过实验验证。