AHL分子荧光法检测质粒的构建(6)
ladder 上海捷瑞生物工程有限公司
250bp DNA Marker plus 上海捷瑞生物工程有限公司
λ DNA-HindⅢ酶切产生的Marker-S 本实验室提供
2.1.3 主要仪器和设备
实验室所需要用到的仪器及厂家信息见表2-3。
表2-3 主要仪器和设备
仪器和设备 厂家
10μL、200μL、1000μL微量移液枪 GILSON公司
GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
BOSCH超低温冰箱 博西华家用电器有限公司
电泳仪 北京百晶生物技术有限公司
HWS12型电热恒温水浴锅 上海恒科仪器有限公司
THZ-98A型恒温振荡培养箱 上海一恒科技有限公司
二氧化碳能培养箱 上海一恒科技有限公司
TB 型分析天平 浙江余姚市金诺天平仪器有限公司
BHC-1300ⅡA2型生物安全柜 苏州苏洁净化设备有限公司
ZF-90型暗箱式紫外透射仪 上海顾村电光仪器厂
FR-200A全自动紫外与可见分析装置
TGL-16G离心机 上海复日科技有限公司
上海安亭科学仪器厂
冷冻离心机
制冰机 上海恒科仪器有限公司
上海恒科仪器有限公司
YXQ-LS-30 SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
TGL-16G 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂
96孔板 浙江拱东医疗科技有限公司
干式恒温器 杭州奥盛仪器有限公司
2.1.4 主要器皿
实验室所需要用到的器材及规格信息见表2-4。
表2-4 主要器材
器材 规格
锥形瓶 250mL、500mL
培养皿 35mm
试管 5mL、10mL
移液管 10mL
PCR管 0.2mL
EP管 1.5mL
2.1.5培养基及试剂的制备
(1)LB液体培养基：称取25g LB medium Broth, 溶解于1L蒸馏水中。
(2)LB固体培养基：称取25g LB medium Gel, 溶解于1L蒸馏水中。
(3)IPTG100×：0.238gIPTG粉末、10mL超纯水。0.2μm滤膜过滤。
(4)卡那霉素1000×：0.5g卡那霉素粉末、10ML超纯水。0.2μm滤膜过滤。
2.2 本研究所涉及的技术
2.2.1 质粒重组技
先用限制性内切酶切割载体质粒和目的基因片段，然后体外使两者相连接，再用所得到的重组质粒转化细菌，即可完成。
2.2.2 PCR技术
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟，2~3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。
2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，常用于分离纯化那些分子大小、电荷形状或分子构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。