灵芝两阶段发酵研究+文献综述(4)
液体发酵培养又称作是深层培养，是菌体在特定的培养液、合适的温度和通气条件下，快速获得所需的目标产物的一种培养方法。Itumleld用液体发酵技术成功培养了蘑菇(Aguricus bispirus)菌丝体在1947年[1]，这就可以证明美国是最先运用发酵技术培养食药菌菌丝体的国家。我们国家在1958年的上海植物生理研究所微生物研究室做的关于液体发酵技术最早的报道是对侧耳、蘑菇菌丝体进行了液体发酵培养[1]。之后我国又报道了关于虫草和灵芝的发酵培养，目前在我国运用液体发酵培养技术已经开发出了一系列的药品和保健产品。
现阶段对食药用真菌发酵的研究一方面主要集中在优化发酵过程中营养因子(碳源、氮源、培养基配方)和非营养因子(pH、温度、装液量等)，以提高目标产物的产量，降低发酵的成本。余素萍等[14]筛选出菌株GL31，其目的是筛选出灵芝菌丝体胞内总三萜产量最高的灵芝菌种；同时得到最适起始pH、装液量、 接种量、培养时间；在优化条件下灵芝菌丝体胞内总三萜产量可以达到3.51×10-2g/100ml。刘华[15]等优化了樟芝的发酵条件。另外一些研究则是在优化发酵培养基的同时，采用其它方法来提高目标产物的产量。Fang等[16]以提高灵芝酸的产量为指标，对液体发酵—液体静置培养的两阶段培养法的培养条件进行了优化。
方庆华等[17]以灵芝菌丝体多糖和灵芝酸为指标，对液体发酵技术的培养基质做了优化，得出了能提高灵芝菌丝体多糖和灵芝酸的最适培养基的蛋白胨和酵母膏的体积含量、体积接种量、起始糖浓度以及最适装液量，还发现灵芝多糖和灵芝酸的产量的普遍规律：细胞量的增加是提高灵芝多糖和灵芝酸产量的基本条件。
一些研究报道显示在细胞培养过程中添加真菌激发子可以促进代谢产物的产量。
1.2.5 三萜类化合物的提取方法
(1) 有机溶剂提取法
目前对三萜类化合物的提取大多数采用有机溶剂提取法，大多数是用甲醇，乙醇和氯仿等溶剂。马林等[25]对于冷浸法和回流法以及超声提取法提取灵芝子实体中三萜成分做了比较，结果显示使用95%的乙醇、氯仿和甲醇三种有机溶剂时提取的三萜类化合物得率最高的是氯仿回流法。徐鹏等[26]运用了响应曲面法优化了用乙醇提取灵芝菌丝体胞内灵芝酸时乙醇浓度、固液比、提取温度和时间等因素对灵芝酸的影响。
(2) 超声波提取法
罗莹等运用了超声波浸提法，在灵芝菌丝体中提取总三萜，研究结果表明影响提取灵芝总三萜的主要因素是超声前浸泡时间和超声时间，乙醇浓度和超声功率的影响不是很显著。此外姚松君等以灵芝三萜得率为指标，发现超声后有助于三萜提取率的提高；并采用正交实验法优化了超声波法提取灵芝总三萜工艺，筛选出最佳的超声功率、超声时间、提取温度、乙醇浓度等因素，在优化的条件下灵芝总三萜提取率的得率能达到1.141%。
(3)超临界二氧化碳提取法
超临界CO2萃取技术的优点是：无毒、安全、提取率高，有利于脂溶性物质的提取和保护活性物质的活性等。一些研究报道表明超临界CO2法适合分离提取生物体的有效成分，特别是油脂、色素类物质等药用成分。
杨军等在超临界CO2萃取灵芝总三萜的工艺研究中显示，赤芝作为原料，运用响应曲面法优化影响灵芝总三萜萃取率的因素，如萃取压力，萃取温度和夹带剂用量等。
章慧等则通过单因素实验筛选出最佳的原粒粒度和夹带剂浓度，并用正交实验法优化了萃取压力、萃取时间和温度等影响灵芝三萜萃取率的因素。而且通过HPLC分析超临界法萃取物中三萜含量和种类都比乙醇提取法要高。