禾谷镰刀菌细胞自噬基因FgATG1生物学功能分析(2)
细胞自噬是真核生物中一种依赖于溶酶体或液泡以降解胞质内容物的溶酶体途径，在进化过程中高度保守，参与细胞对外界刺激发生反应，并且参与发育过程[6]。细胞在受到外界条件刺激（如饥饿、激素作用、低氧、高温）或在内部条件发生变化的情况下都可以产生细胞自噬[7]。细胞自噬可以调节细胞内长寿蛋白和细胞器的降解，降解产物再被细胞重新利用，因此细胞自噬也是一种物质循环利用途径[7]。细胞自噬现象最初是在酿酒酵母中被描述，并且Tsukada等对其自噬相关的基因突变体以Atg进行了命名和性质研究[8]。酵母已经成为细胞自噬分子机制研究最为透彻的模式生物，而对于丝状真菌中自噬途径的研究还不是十分透彻，主要集中在模式真菌稻瘟病菌中[9]。根据前人的研究可知，细胞自噬在丝状真菌的产孢、程序性细胞死亡、致病及促进细胞生存过程中发挥重要作用[10,11]。研究小麦赤霉病菌的细胞自噬途径有助于深入了解菌体的生理生化、致病机制和次级代谢途径，为科学防治小麦赤霉病和新药剂研发提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
禾谷镰刀菌测序菌株PH-1
1.1.2供试培养基
PDA固体培养基：称取约0.2kg马铃薯切块放入沸水中煮烂后加入20g葡萄糖混匀，定容至1L，分装并每200ml约加入3g琼脂粉后灭菌。
CM固体培养基：Glucose 20 g，Peptone 4 g，Yeast Extract 2 g，Casein acid 2 g，NaNO3 12 g，KCl 1 g，MgSO4•7H2O 2 g，KH2PO4 3 g，琼脂 30 g，定容至2L，调节 PH 至 6.5。
MM固体培养基：K2HP04 2.28 g，KH2PO4 1.36 g，(NH4)2S04 0.53 g，NaCl 0.15 g，MgS04•7H20 0.49 g，CaCl2•2H20 0.07 g，FeSO4 2.5 mg，Glucose 1.98 g，定容至1L，调pH值至6.9。
YEPD液体培养基：在0.9L纯水中加入10 g蛋白粉、3g酵母提取物、20 g葡萄糖并混匀后调节pH值至7.0，再加纯水定容至1L。
CMC液体培养基：Carboxumethyl cellulose 15 g，酵母提取物1 g，NH4NO3 1 g，KH2PO4 1 g，MgS04•7H20 0.5 g加纯水定容至1升。
绿豆汤产孢培养基：10 g绿豆在纯水中煮沸后，用纱布过滤，加纯水并定容至1L。
RM培养基：在纯水中加入1g酪蛋白水解物、1 g酵母提取物、274 g蔗糖后将pH值调节至7.0，再加纯水定容至1L。
以上培养基都需要在20min的121℃高压灭菌后使用。
1.2方法
1.2.1小麦赤霉病菌种保存
禾谷镰刀菌菌株在PDA固体培养基上培养2 天后，用灭菌牙签挑取少许菌丝块接种在PDA固体培养基斜面上，25℃培养3至5天后，在4℃冰箱中长期保存。
1.2.2菌丝体获得
将接种针蘸取少许酒精用酒精灯火焰烧红后冷却。从保存菌株的冷冻管中，用接种针挑取少量菌丝块放在PDA固体培养基上进行活化，培养4天之后转接到新的PDA培养基上再培养3天，在新形成的菌落边缘用灭菌的打孔器打取5mm菌碟接种到YEPD液体培养基中，在25℃、175rpm 条件下培养3天后收集菌丝。
1.2.3用CTAB法提取DNA
1)将10 ml 含100μL巯基乙醇的CTAB抽提液置于灭菌的50 ml离心管中，离心管放入65℃水浴锅预热1h后备用；
2)用无菌水冲去残留在收集的菌丝上的培养液，并尽量将获取的菌丝中的水分用吸水纸吸干；
3)在研钵中加入液态氮将菌丝研磨成粉并用无菌铁勺加约两勺粉末到上述备用的CTAB抽提液中，涡旋震荡至完全混匀后65℃温育2h且每20 min一次上下翻转，使溶液保持均一状态；
4)将混合液在常温下9600 rpm离心10 min后用灭菌移液枪将上清液体小心移至干净的无菌离心管中；
5)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液；
6)重复步骤4），若上层液体仍为白色浑浊状态，则重复步骤5）；