烟草蚀纹病毒蛋白酶调控的人工变构酶的初步设计(3)
分已有环式重排蛋白的活性变化规律设计预测软件[13-14]
；3）基于蛋白质拆分的设计，尝
试在完整蛋白与分裂蛋白的活性差异中引入调控转换,如通过蛋白酶的特异性切割作用，
暴露降解标签，对目标蛋白的降解产生影响（图 1E），基于酶分裂后的片段互补能力，
设计实用性的蛋白质工具等等（图 1F）[15-27]
。也可以进行组合设计，如通过解构复杂蛋
白质的独立功能结构域，从原有蛋白中拆分出模块化的片段后再进行重新组合，创造全
新的功能，例如改变双组分信号转导线路的特异性，改变 MAPK 信号线路的走向，创造
多位点蛋白支架控制代谢流等等[18-20]
。已有的研究为蛋白质变构调控提供了多种设计思
路，展示了在影响蛋白活性的各个方面都具有对其进行理性设计的可能性。但当前的变
构调控研究还有亟待补充和完善之处：在蛋白层次进行调控的功能元件数量很少，制约
了当前的发展；对于功能元件的表征度不够，对一些关键的参数，如动态变化范围
（dynamic range）、灵敏度（sensitivity）、响应区间及有效希尔系数等缺乏描述；对于功
能元件的描述与刻画过于粗略，缺乏定量的研究；功能元件的质量不过关，在灵敏度和
特异性等方面还有进步空间；尚未出现普适性的设计原则和元件刻画方式等。而对元件
进行收集、表征、优化、再利用可以说是合成生物学发展的原初推动力，在此基础上才
能实现设计原则标准化，功能互作正交化，元件封装模块化等工程学理念，进而开发真
正具有实用价值的功能系统。
本研究从最基础的应用元件的设计出发， 利用β-半乳糖苷酶片段互补与环式重排两
种构型的天然活性差异以及 TEV 蛋白酶特异、高效的切割能力，初步设计了一个在翻
译后水平发挥活性调控功能的元件组合。通过半理性地筛选，找到了 β-半乳糖苷酶两种
构型之间活性差异最大的拆分方式，并通过引入 TEV 蛋白酶的切割位点，成功地实现
了 TEV 蛋白酶对改造的 β-半乳糖苷酶的变构调控。在此基础上还优化了定性与定量实
验的研究方法，并基于模型分析了双酶级联系统放大器的本质特征。
1 材料与方法
1.1主要实验材料
1.1.1 菌株与质粒
实验用菌株与质粒均来自本实验室。DH5α菌株（F-
endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1
gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-
mK+), λ–）用于载体构建，BW25113 菌株（F-, Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-
, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568,
hsdR514）用于定性与定量测试。基础质粒 S0001 号与 S0002 号分别用于构建 β-Gal 和
TEV蛋白酶的表达质粒，本文所有构建质粒及相关质粒信息均见附录 C。
1.1.2 培养基与基础试剂配制
LB 液体培养基：每 1 L培养基中含胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。用
前经121 ℃、102.9 kPa高压蒸汽灭菌30 min，常温保存。
LB 固体培养基：每 1 L培养基中含胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼
脂糖15 g。用前经121 ℃、102.9 kPa高压蒸汽灭菌30 min，常温保存。
Ampicillin 抗生素：取适量抗生素干粉，超纯水溶解至100 mg/mL，0.22 μm 水相滤
膜过滤除菌，分装至 1.5 mL离心管，-20 ℃保存。使用时加入培养基中，并保持终浓度
为100 μg/mL。 基中，并保持终浓度为 100 μM。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂：取适量诱导剂干粉，超纯水溶解至 2