基于CRISPR/Cas9技术的稻曲病遗传转化体系的建立及基因敲除载体的构建(2)
CRISPR /Cas9 系统是一种细菌或者古细菌中的后天免疫防御系统，其功能是保护古细菌和细菌免受外来噬菌体或质粒的侵入。这类细菌或古细菌基因组的CRISPR序列能够表达与入侵者基因组序列相识别的RNA。当噬菌体或质粒等外源DNA入侵菌体时，该防御系统的CRISPR序列会相应的表达这类RNA 并通过互补序列结合和识别入侵者的基因组序列，然后CRISPR 序列的相关酶(Cas)在序列识别处切割入侵的外源基因组DNA，从而达到抵制入侵的目的。近几年来兴起的基因组定点编辑技术主要包括以下几种DNA核酸酶：锌指核酸酶(ZFNs)，归巢核酸内切酶，类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)等[2]，它们均依赖于在特异位点产生的DNA双链断裂，激活细胞内DNA修复机制，如同源重组和非同源末端的连接，导致特异位点的编辑。然而，TALANs和ZFNs操作技术复杂，且对DNA甲基化较为敏感，因而限制了其大范围的应用。CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas system)是于2013年新发现的基因组编辑技术，不但能克服以上缺点[3]，而且可以同时编辑多个基因，大大提高了基因编辑的效率，因此具有更大的应用潜力。目前，CRISPR/Cas9系统已经作为一种高效的基因定点编辑技术而广泛应用于植物研究中[4]。
基于CRISPR/Cas9技术建立稻曲病基因敲除载体，构建遗传转化体系的并筛选转化子，对稻曲病致病机理进行深入研究[5]。稻曲病菌遗传转化体系的建立,将为分析稻曲病菌的致病机理和研究遗传变异机制打下基础。在对稻曲病菌致病机制研究的基础上,根据稻曲病侵染循环中各个阶段的特点,进行有针对性地研究各种防治策略, 设计开发和筛选有效防治药剂,研究用药时期与方法,才能有效的指导稻曲病的田间防治, 从而有效控制稻曲病的为害。
本实验在已经掌握的常用转化体系的基础上，采用CRISPR/Cas9技术，构建稻曲病菌的遗传敲除载体，大大提高同源重组效率[6]，建立稻曲病的遗传转化体系。实验的研究结果将帮助我们构建稻曲病菌功能基因PDEH的遗传转化体系[7]，为进一步阐明PDEH基因的特殊致病机理提供理论基础，并对其他功能基因的特殊致病机理的研究具有重要借鉴意义。同时，对开发新型稻曲病菌的杀菌剂，开发高效低度的稻曲病菌控制策略同样具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1供试的菌株和培养基
本研究使用稻曲病菌野生型菌株、Pdeh和Mac基因敲除突变体菌株均采用滤纸片法保存于-20℃。菌丝体PSA培养基中培养七天，用于稻曲病分生孢子的制备。PSA固体、PSB液体培养基：马铃薯去皮200g，煮沸30min左右至软，加20g蔗糖，超纯水定容至1L，PSA固体培养基加15gAgar Powder。TB3液体配制：Yeast Extract 3g；Acid hydrolyzed casein 3g蔗糖200g；补超纯水至1L 121℃ 灭菌20min。STC buffer：蔗糖 100g；0.5M Tris-cl(PH8.0) 50mlor1MTris-cl(PH8.0) 25ml；补超纯水至500ml 121℃灭菌 20min。PTC8000：PEG8000 40g；补STC 至100ml 121℃灭菌 20min。1.2M Kcl：Kcl固体89.46g；补超纯水至1L 121℃ 灭菌20min。TB3 Bottom/Top培养基：Yeast Extract 3g；Acid hydrolyzed casein 3g；Agar Powder Bottom、Top各加10g、15g；补超纯水至1L 121℃ 灭菌20min。