棉铃虫种群Bt抗性检测及显隐性分析(3)
运用张浩男（2011）等人[23]阐述的方法。从高阳棉田采集棉铃虫雄蛾和雌蛾，交配
后得F1代。F1代试虫经1μg/cm2 Cry1Ac毒素筛选，存活试虫饲养至成虫。存活个体与敏感品系（SCD）单对杂交，得F2代。F2代经1μg/cm2 Cry1Ac筛选后混交，其后代再进行筛选多次，得到较纯的高抗品系（GY♀30）。该品系成虫与实验室内敏感品系（SCD）单对测交，子代在区分剂量下进行筛选，检测其纯化度。
图1 GY♀30品系的分离方式
1．4 高通量筛选法
（1）移取60℃左右的人工饲料至24孔培养板的孔底，每孔900 μL，拍打至液面平整，孔壁、孔口不粘结饲料，在室温自然凝结；
（2）将Bt毒素Cry1Ac用0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.4）稀释成2μg/100μL；（3）待饲料冷却固定后，每孔加入100 μL的毒素溶液到饲料表面，室温下晾干后备用；
（4）在24孔培养板中每孔接入4-6头初孵棉铃虫幼虫，用保鲜膜包好后，再包两层尼龙纱覆盖防止试虫逃逸，置于恒温光照培养箱（26 ± 1℃，16L：8D，RH 60%）饲养，7天后检查结果；
（5）完全死亡或生长发育受到严重抑制（体重小于5 mg）的都作为死亡，幸存者留种后保存。
1．5 单对测交实验
（1）制备糖球，取适量棉花，用糖水浸湿后，搓成球状，放入底部钻孔的一次性杯中。
（2）用指形管从虫体头部套取当天羽化的棉铃虫成虫，以田间品系♀×SCD品系♂或田间品系♂×SCD品系♀的两种组合方式放入杯中，并盖上方块纱布，用皮筋固定。
（3）将杯子横放在不锈钢托盘中,纱布面朝外。
（4）贴上写有田间品系虫子雌雄区分及时间的标签，并编号，后放入交配室中培养。
（5）开始产卵后，每日将产卵的纱布换下放在11℃温箱内备用，并补充糖水。记录纱
布数量和日期。当纱布数量大于三张后，可以将纱布放置在26℃培养室中24h后，观察有效卵。
（6）卵孵化后，在准备好的移取有人工饲料的24孔培养板上，均匀喷上100 μL用0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.4）稀释成2μg/100μL的Bt毒素Cry1Ac，自然晾干后，在24孔培养板中每孔接入1头初孵棉铃虫幼虫，每一家系使用两块24孔培养板，并用保鲜膜包好，后再包两层尼龙纱覆盖防止试虫逃逸，贴上标签后，置于恒温光照培养箱（26 ± 1℃，16L：8D，RH 60%）饲养，7天后检查结果，记录存活个数。