Fluralaner对二化螟的毒力测定及其靶标受体的克隆分析(3)
3.1 饲养器具的清洗及消毒
养虫瓶灭菌：将使用后的养虫瓶置于84消毒液的稀释液中浸泡24h后，用清水洗净，再通过121℃湿热灭菌15min，80℃烘干冷却后，用保鲜膜覆盖瓶口备用。
滤纸灭菌：121℃湿热灭菌15min，80℃烘干备用。
3.2 水稻幼苗培养
选用清洁稻种放置盆中，用清水淘洗干净并去除瘪粒。使用60℃左右温水浸种10min。浸种之后，将稻种反复淘洗干净，然后加入适量冷水，置于室温下（25℃）浸泡24h。将浸泡好的稻种转移至搪瓷盘中，用浸湿的黑色纱布覆盖，置于28℃温室内催芽，在此过程中需保持纱布及稻种的湿度，48h左右稻种生根发芽。播种时选用经高温灭菌的养虫瓶，瓶底放置1-2张经湿热灭菌的滤纸，每瓶少量播种，以铺满瓶底1cm左右为宜。播种之后，用保鲜膜封住瓶口，并用灭菌过的镊子在保鲜膜上戳几个孔以通气，在此过程中同样需要注意保持水稻种苗的湿度。
3.3 虫源采集
通过剥查稻桩，在江西省南昌市周边的水稻田采集的越冬的二化螟老熟幼虫。
3.4 幼虫饲养
向每个养虫瓶中放入100-200头二化螟幼虫。因为二化螟幼虫具有极强的趋光性，
因此，应用黑布紧封瓶口，以防幼虫逃逸[10]。
依据二化螟的取食情况，每隔48h左右更换水稻种苗和养虫瓶，期间若发现死虫应
将其挑出。在养虫瓶上贴标签纸用以记录更换的日期。
3.5 化蛹管理
当二化螟幼虫生长发育至老熟阶段时，可在瓶口处放置具折痕的滤纸，供其化蛹。
其中也存在部分老熟幼虫爬至瓶口附近及黑布上吐丝化蛹的情况。更换水稻种苗时，需
将养虫瓶内的老熟幼虫与蛹及时挑出，将挑出的老熟幼虫放置在铺有单层滤纸的培养皿中，撒上适量的水以保证一定湿度，供其化蛹[10]。
3.6 羽化及产卵
当蛹快要羽化时，将其移入围有透明罩的盆栽水稻中，可以促使成虫产卵，观察并记录成虫产卵情况[11]。产卵后，将覆有卵块的水稻叶片剪下，放置在铺有单层滤纸的培养皿中，待其孵化后再移入养虫瓶中。
第二章 Fluralaner与氟虫腈对二化螟的毒力测定
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
室内饲养的二化螟品系。选用同一世代的4龄幼虫（9.00-11.00mg/头），饲养方法参照第一章。
1.2 供试药剂
杀虫剂（Insecticides） 含量（Percent） 来源
Fluralaner >99% 实验室存放
氟虫腈 92% 实验室存放
1.3 毒力测定方法
毒力测定方法参照《水稻二化螟抗药性监测技术规程毛细管滴定法》（NY/T 2058-2011），加以改进，适用于二化螟4龄幼虫的毒力测定[12]。在电子天平上称取原药，使用丙酮溶解，配制成一定浓度的母液。将溶解后的母液分装于2mL离心管中，冷储于-20oC。用移液枪吸取一定量的母液，用丙酮等比稀释成6-7个浓度备用，以丙酮作为对照，每管不少于2mL。
挑取9.00-11.00mg的二化螟4龄幼虫，按照供试药液浓度由低到高的顺序处理。用微量点滴器吸取药液点滴于试虫中胸部背面，每头试虫点滴1μL，每个浓度处理30头。将点滴后的试虫置于种有水稻种苗的平底大试管中，每个试管放置10头，设3次重复，对照组点滴等体积丙酮。将处理后的试虫放回原饲养环境中，于24h和48h时观察幼虫存活情况，以毛笔轻触虫体，虫体不能协调运动为死亡标准[13]，记录死亡数和总数。
1.4 统计分析方法
采用POLO PLUS(LeOra Software, 2003)软件计算毒力回归方程。计算参数包括b值、LC50及其95%置信限[14]。