表观遗传调控因子OsNRPE1b与OsRDM1蛋白互作验证(2)
真核生物有3种DNA依赖的RNA聚合酶，分别是PolⅠ、Pol II和PolⅢ。而植物还有另外2种特有的DNA依赖的RNA聚合酶Pol IV和Pol V，它们都是从Pol II进化而来的。[4]Pol IV和Pol V在RdDM途径中起到重要的作用，Pol IV的转录产物最后加工成24nt siRNA，而Pol V转录出的长非编码RNA作为支架用于招募染色质修饰蛋白，对染色质进行DNA甲基化等修饰。Pol II、Pol IV和Pol V各自都有12个亚基，在这12个亚基中，有一些亚基是它们共有的，而有一些亚基是特有的。在拟南芥中，Pol II 的最大亚基NRPB1有一个高度保守的，含有7个重复基序的C端结构域（CTD），但是Pol IV和Pol V的CTD却不含有这些重复。在10个没有催化活性的亚基中，Pol IV和Pol V有4个亚基不同于Pol II ，而在这其中Pol IV和Pol V有2个亚基存在差异。[12]不同于拟南芥，玉米Pol IV和Pol V拥有相同的没有催化活性的亚基，但是玉米有两个NRPD2,分别是ZmNRPD2a和ZmNRPD2b，并且有ZmNRPE2a、ZmNRPE2b和ZmNRPE2c这三个NRPE2,因此玉米有2个Pol IV，3个Pol V。[13]Pol IV和Pol V的第二大亚基NRPD2/NRPE2是相同的，它们分别与NRPD1和NRPE1组成催化中心。[14]NRPE1是Pol V的最大亚基，它与Pol II的最大亚基NRPB1的不同在于，在它们的催化中心和CTD保守的氨基酸序列发生替换或删减，这使NRPE1在RdDM途径中有特殊的功能。[14]NRPE1的CTD含有DeCL-like结构域，而NRPB1没有。据现在的研究表明，DeCL蛋白参与rRNA的加工[15]，但是NRPE1中DeCL-like结构域的功能目前还不清楚。除了含有DeCL-like结构域，NRPE1的CTD还含有WG/GW重复形成的AGO hook基序，AGO hook基序可以和AGO4互作，在siRNA介导的从头甲基化中起到重要的作用。[16] 在拟南芥中只有一个NRPE1，在玉米中也是如此，但是水稻中有OsNRPE1a和OsNRPE1b这两个NRPE1。[17]
Pol V在RdDM途径的下游起到重要的作用。Pol V转录出的支架RNA作为支架用于招募染色质修饰蛋白，对染色质进行DNA甲基化等沉默修饰。Pol V被招募到位点需要METHYLTRANSFERASE 1（MET1）文持的DNA甲基化，其作用位点大都分布在基因的启动子区以及新进化的转座子上。[18]SUVH2和SUVH9都有SRA结构域，可以与甲基化的DNA相结合，而在体内DRD1，DMS3和DMS11与SUVH2和SUVH9在物理上能相互作用。[19]这说明甲基化的DNA先被SUVH2或SUVH9识别，然后DDR-DMS11复合物被招募过来，从而促进Pol V转录。AGO-siRNA复合体通过与Pol V转录出的支架RNA碱基互补配对，找到靶位点。当NRPE1发生突变时，在突变体中Pol V的转录受到阻断，但其亚基的装配没有受到影响，这时AGO4无法与染色质产生联系。[20]这说明在将AGO4招募到目标位点时，siRNA与支架RNA间的碱基互补配对起到主要作用。AGO4被招募到支架RNA后， IDN2和它的同源蛋白IDP1和IDP2形成IDN2-IDP1/IDP2蛋白复合体，结合到支架RNA上，随后DRM2被招募过来。[11]SWI/SNF染色质重塑复合体通过它的一个亚基SWI3b和IDN2-IDP1/IDP2蛋白复合体产生相互作用从而被招募到沉默位点。同时SWI3b能使RdDM目标位点的核小体稳定，从而促进DRM2对目标位点进行甲基化。[21]
Pol V转录出的支架RNA在RdDM途径中起到重要作用，此外Pol V本身也与参与RdDM的多个蛋白相互作用，参与到RdDM中。体内、体外的免疫共沉淀、质谱分析和酵母双杂交的实验结果表明，Pol V和AGO4/6/9、KTF1、DRD1、DMS3、RDM1、DMS4几个蛋白能相互作用。[12]DRD1属于依赖ATP的染色质重塑因子SWI2/SNF2家族，其功能可能是重塑染色质，从而有利于Pol V转录。[22]它与DMS3和RDM1所形成的DDR蛋白复合体能直接与NRPE1相互作用，促进Pol V转录lncRNA。[23]DMS3编码一个与SMC相同的hinge结构域，因此猜测DMS3可能有结合或者稳定siRNA-RNA的作用。[24]RDM1是植物特有的蛋白质，它有一个特殊的pocket like结构，这个结构能选择性地与甲基化的单链DNA结合，并且RDM1与AGO4和DRM2存在相互作用的关系。[25]KTF1蛋白也有WG/GW-rich结构域，也能与AGO4相互作用。KTF1不仅能和Pol V以及AGO 4蛋白相互作用，还能结合Pol V转录的支架RNA。[26][27]DMS4作为PolII和Pol V的调控因子，它在体内能与PolII和Pol V相互作用。酵母双杂交实验结果表明DMS4能与Pol IV和Pol V最大亚基C端的DeCL-like结构域相互作用。[28]