表观遗传调控因子OsNRPE1b与OsRDM1蛋白互作验证(3)
本实验Split-LUC来验证水稻中OsNRPE1b与OsRDM1相互作用关系。Split-LUC技术是基于烟草瞬时表达的萤火虫荧光素酶片段互补实验。荧光素酶互补实验是一种简单、可靠的检测蛋白间相互作用的方法。相较于酵母双杂交实验在异源条件下检测蛋白间相互作用情况，荧光素酶互补实验能更好的反映植物生理条件下蛋白间互作情况。而与同样在植物生理条件下检测蛋白间互作的荧光能量共振转移技术（FRET）和双分子荧光互补技术（BiFC）相比，Split-LUC技术能在几个数量级范围内线性测定荧光信号，不受植物自发荧光的干扰，并且操作简单。[29]其原理是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase, LUC）被分割为N端和C端两部分，这两部分不会自发重组并产生作用。只有当分别与这两部分融合表达的两个蛋白间存在相互作用时，萤火虫荧光素酶的两部分在空间上相互靠近，从而又重新形成荧光素酶，获得了酶活性。当加入特定的荧光素酶底物时，荧光素酶即可水解底物，产生荧光，可被CCD照相机检测到荧光信号。[30]
植物的DNA甲基化修饰在基因表达、生长发育及细胞分化等过程中发挥重要的作用。植物DNA甲基化的改变可以影响植物的形态、育性、花期等，并且在杂种优势、逆境胁迫、植物印记等方面起一定作用。[4]在植物中，RdDM途径是介导转座子、重复序列等序列DNA的甲基化，文持植物基因组稳定及调控基因表达的重要机制。目前对RdDM作用机制的研究主要集中于模式植物，在拟南芥中其发生机制研究的最为透彻，而在其他植物中仍然缺乏研究。体内、体外免疫共沉淀、质谱分析和酵母双杂交实验结果表明，拟南芥中Pol V和AGO4/6/9、KTF1、DRD1、DMS3、RDM1、DMS4几个蛋白间存在相互作用。[12]不同于拟南芥和玉米只有1个NRPE1,水稻中有OsNRPE1a和OsNRPE1b这两种NRPE1。水稻中OsNRPE1b与OsRDM1是否和拟南芥中NRPE1与RDM1一样存在相互作用的关系，弄清楚这个问题有助于更近一步了解水稻中RdDM的发生机制，对于深入了解水稻生长发育的调控机制，解决转基因沉默有着重要的意义。
1 材料与方法
1.1 植物材料
本实验用的本氏烟（Nicotiana benthamiana）在24℃，12h/d的光照，70%的湿度的温室中培养。七周大的本氏烟被用于农杆菌介导的瞬时表达实验来检测蛋白间互作的关系。日本晴幼穗用于提取RNA。
1.2 载体及菌株
为pCAMBIA1300-NLuc以及pCAMBIA1300-CLuc。大肠杆菌菌株为DH5α用于载体的构建,农杆菌菌株GV3101用于烟草瞬时表达实验。
1.3 构建OsNRPE1b-NLuc与CLuc-OsRDM1载体