1  DNA标记技术

1。1 SSR标记来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766

真核生物基因组包含两种重复序列分别：分散重复序列和串联重复序列重复序列。卫星DNA (基序长100～300bp，以至长1000～100, 000bp)、小卫星DNA(基序长1000bp)、微卫星DNA (基序长1～6bp)和中卫星DNA (由各种长短串联重复构成) 等几种类型，是依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联重复序列分的。微卫星具有许多功能，如重组热门、对基因的调节和表达以及性别决定等。SSR标记即简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)或者微卫星序列(Microsatelite，MS)、短串联重复序列(Short Sequence Repeat，STR)是长达几十个核苷酸的串联重复序列，其重复单位一般为2-6个核苷酸，它们遍及分散于各类真核生物基因组的各种位置，并且散布相当平均，平均每10kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列，(AT)n、(A)n、(GA)n、(TAT)n、和(CA)n在植物中出现频率最高(Wang 等，1994)。

虽然开始筛选重复序列、引物设计以及验证过程比较慢，但只要引物确定，SSR标记在使用上简单，成果也十分稳定。SSR优势：⑴数量多，覆盖整个染色体组；⑵具有多等位基因特征，信息含量高；⑶以孟德尔方式遗传，呈共显性；⑷易于使用PCR技术分析，对DNA数目及纯度要求不高，成果重复性好；⑸每个位点由引物序列次序决定，便于交换［1］。如在小麦［2］、水稻［3］、玉米［4］、大豆［5］油菜［6－7］及大麦［8］等中SSR标记都获得普及应用。

1。2  EST概述

表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)是通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行测序所获得的部分cDNA的3' 端或5' 端序列，一般长度为300～500bp左右，平均长度为360±120bp。随着高速自动测序与DNA芯片测序等方法的不断发展使一些生物体基因组测序成为可能，EST标记技术得到了广泛应用，特别是在功能基因组研究中发挥作用巨大，已经成为研究基因最有效的捷径。目前，EST以每周10000个的速度从大量cDNA文库中被开发出来，截至2009年4月10日， NCBI数据库GenBank已公布涉及1726种生物共60, 923, 778条表达序列标签。

2  材料和方法

2。1实验材料论文网

金钗石斛（Dendrobium nobile）（母本）和铁皮石斛(Dendrobium officinale)（父本）及其经杂交获得F1代自交后得到的F2代群体。从F2代群体中无偏选择从中随机选取130个单株作为作图群体。于2016年7月采取健康正常幼叶适量，分别标号带回浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室，清洗干燥后放入-20℃冰箱内，保存待用。取材地点： 浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室基地

2。2  实验方法

2。2。1 DNA的提取

提取DNA前，各种耗材均需提前灭菌。

采集新鲜的石斛叶片，-70 ℃冰箱保存待用。铁皮石斛和金钗石斛的杂交后的石斛基因组DNA提取使用Ezup柱式基因组抽提试剂盒（植物）（上海生工，SK8262）。具体步骤如下：取2-3 g左右的新鲜叶片放置研钵中，加入液氮后迅速研磨至粉末状，将叶片组织粉末装入预冷的2 mL 离心管中。在装有叶片组织粉末的离心管中加入800 μL 2% CTAB溶液（65℃预热），混匀，65 ℃水浴60分钟左右，期间每隔15分钟轻摇一次。水浴后，加入800 μL氯仿-异戊醇(24：l)，混匀摇晃15分钟使其充分反应。第一次放入4℃离心机中8000转，离心10分钟。取上清液放入1。5 mL离心管中，加入500 μL氯仿-异戊醇(24：1)，轻摇10 分钟。第二次放入离心机中10000转4℃离心10分钟。取上清液转入1。5 mL离心管中，加入冰冻的无水乙醇和1/10体积的NaAC (3 M)，轻轻混匀，-20 ℃静置1小时左右。第三次放了离心机中10000转0℃离心10分钟。倒出液体，若沉淀有颜色，用70%的酒精漂洗1～2次。真空抽干后TE缓冲液溶解，加1μL RNA酶(50 ng/μL) 37℃消化2～3小时。取的DNA溶解于TE缓冲液里，用分光光度计检测DNA浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。最后每份DNA确保无降解无污染，且总量在1μg以上（浓度≥25 ng/μL），4 ℃冰箱贮藏备用。文献综述