稻瘟病菌蛋白磷酸酶MoPtp1, MoPtp2的功能分析(2)
引言 稻瘟病作为现阶段全球范围内广泛发生的水稻真菌病害，严重危险世界粮食安全。其病原真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)现如今已成为研究植物—病原菌互作的重要模式生物[3]。在稻瘟病菌侵染水稻的过程中，该并病原菌通过分生孢子在风，雨水等作用下附着于水稻表面，进而萌发产生芽管，随着芽管顶部分化成的附着胞进一步侵染水稻。附着胞内产生出甘油等物质通过积累产生巨大的膨压，在膨压的作用下形成的侵入钉穿透叶片并产生侵入菌丝并形成病斑。随后病斑处会产生大量的分生孢子，参与到新的侵染循环中[4]。
长期以来，人们普遍关注激酶的功能及蛋白质的磷酸化过程，对其生物学功能及其分子调控机制进行了一系列研究，而对将蛋白质去磷酸化的磷酸酶研究较少。近年的研究发现，磷酸酶在生物体中也具有重要的功能，磷酸酶与激酶一样在细胞信号网络的调控中发挥着不可或缺的作用。传统意义上的蛋白磷酸酶家族主要分为三类：水解磷酸酪氨酸残基的酪氨酸蛋白磷酸酶、水解丝氨酸/苏氨酸残基的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、识别并水解这两类残基的双特异性蛋白磷酸酶(DSPs) [5]。在酿酒酵母中，多个蛋白磷酸酶的功能得到解析，发现其主要通过去磷酸化作用参与信号传导、有性生殖和胁迫应答[6]。而在丝状真菌中磷酸酶的功能及其调控机制鲜有报道，仅在构巢曲霉中发现蛋白磷酸酶参与有丝分裂过程 [7]；在小麦赤霉病菌中发现蛋白磷酸酶参与调控病菌的生长发育及致病过程[8]，但是在上述报道中，磷酸酶去磷酸化的分子调控机制并不清楚。在真核细胞中，蛋白质的磷酸化和去磷酸化参与基因调控、信号传导以及细胞周期过程[2]。促分裂活化蛋白激酶（MAPKs）控制真核生物中的许多细胞过程，例如增殖，分化，程序性细胞死亡和应激反应。
在酿酒酵母中有研究报道，Ptps作为一类蛋白磷酸酶参与MAPK信号途径的反馈调节作用，但是其在丝状真菌中的功能还鲜有报道,为了解析蛋白磷酸酶MoPtp1、MoPtp2在稻瘟病菌生长发育及致病中的作用机制，本研究通过同源重组的方法对蛋白磷酸酶MoPtp1、MoPtp2 进行了基因敲除。得到敲除突变体后进行生物学表型分析，发现MoPtp2的缺失导致稻瘟病菌产孢量下降，致病力降低，而Moptp1缺失后稻瘟病菌致病力及产孢量方面并无显著性变化。随后，通过PEG介导的原生质体转化的方法获得MoPtp1、MoPtp2互补菌株，发现互补菌株与野生型菌株Guy11生长、产孢、致病力基本一致，对其作用的分子机制进行分析，从而阐明蛋白磷酸酶MoPtp1、MoPtp2在调控稻瘟病菌生长以及致病力的作用。
研究结果不仅对揭示蛋白磷酸MoPtp1、MoPtp2在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的分子机制具有重要的理论和实践价值，而且对设计高效、低毒的真菌病害控制策略具有重要的参考价值，对揭示其他丝状真菌的Ptp1与Ptp2的功能具有指导价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 项目采用的稻瘟病菌及其培育条件
在本项目中，采用的供试稻瘟病菌菌株分别是：基因敲除突变体菌株∆MoPtp1、∆MoPtp1,回补菌株∆MoPtp1/MoPtp1、∆MoPtp2/MoPtp2以及野生型菌株Guy11。
在本项目中，采用的培养基有：完全培养基(CM)[6] 、玉米稻草培养基SDC（ 100 g秸秆；40 g玉米粉；15 g琼脂；1 L蒸馏水。SDC主要用于稻瘟病菌的产孢培养) 。燕麦培养基OM（50 g燕麦片；15 g琼脂；1L蒸馏水）和基本培养基OM和MM主要用于测稻瘟病菌的生长。用PEG介导的稻瘟病菌原生质体转化筛选转化子所用培养基为TB3培养基（3 g 酵母提取物；3 g 酪蛋白提取物；200g蔗糖；1L蒸馏水）。