稻瘟病菌蛋白磷酸酶MoPtp1, MoPtp2的功能分析(3)
1.1.2项目采用的酵母及其培养条件
酵母菌株XK-125是本项目的供试酵母(使用前利用甘油法保存于－70°C的环境中)，接种酵母的培养基为YPD培养基(10 g 酵母粉；20 g 蛋白胨；20 g 葡萄糖；15g琼脂；1L蒸馏水)，培养环境：30℃避光培养。构建荧光互补载体菌株所使用培养基为SD-Trp培养基（0.74 g Trp ；6.7 g酵母提取物；182.2 g山梨醇；20克琼脂；1L蒸馏水，调pH至5.8冷却至50℃添加40毫升50%葡萄糖。）
1． 2 方法
1.2.1 构建目的基因敲除载体
敲出载体的制备主要运用同源重组的原理，设计目的基因上下臂的特异性引物，利用PCR扩增技术扩增上下臂基因序列各约1 kb，紧接利用酶切连接的原理，用特定的限制性内切酶分别酶切上臂基因序列以及测序正确的pCX62载体质粒。经过T4连接酶的连接后转入到大肠杆菌感受态细胞中，最后提取已经验证具有氨苄抗性的菌落质粒。获得上述质粒后再运用同样的方法步骤连接下臂质粒，获得用于同源重组的pCX62置换载体后，送去测序公司测序，测序正确后用于转化。
1.2.2 稻瘟病菌原生质体的转化
稻瘟病菌的原生质体转化主要是运用聚乙二醇（PEG）介导的方法，将敲出载体转化到野生型Guy11菌株中。
1.2.2.1 原生质体的制备：
(1) Guy11菌株的活化：无菌条件下，将菌落直径约2mm菌丝块接种于CM平板上培养7 d左右。
(2)超净台下，切取上述菌株直径大小约3 mm的菌落，放置于CM的液体培养基（100ml左右）中，在28°C、150 rpm的环境下振荡培养2 天；
(3)用单层滤纸过滤菌丝，用吸水纸将菌丝压干待下一步使用；
(4)配制破壁酶解液（0.3g几丁质酶、30ml 0.7mol/L NaCl，使用前用细菌过滤器过滤），将压干的菌丝放入酶解液中，在30℃ 60rpm的摇床里振荡酶解2h。
(6)用灭菌双层滤纸过滤酶解后的菌丝体，留上清液，将滤液收集于50 ml离心EP管中；
(7) 在4°C水平离心机中低温离心10min，转速3000 rpm；
(8) 在弃上清后，先加1mlSTC，用剪过的枪头吹打悬浮原生质体，再加STC至15ml后，在4°C离心机里3000 rpm离心10 min；
(9) 再次重复步骤（8）；
(10) 加适量的STC吸打悬浮，在显微镜下镜检计数，根据原生质体数目来确定浓度（一般为10^8个/ml），最后分装150 µl/管。
（11）加1mlPTC后上下颠倒混匀，静止30min后加入含1%氨苄的TB3液体培养基6-8ml，扩培2h;
(12)在200mlTB3培养基里加300ul潮霉素，将扩培后的原生质体加入培养基中后倒板，10ml/板，吹干后倒第二层培养基（200mlTB3中加600ul潮霉素）。
（12）在28℃温箱中培养7天。
1.2.2.2获得转化子
（1）培养3天后，挑取菌落中的菌丝接种于含3ul/ml潮霉素抗性的TB3培养基中，28℃培养7天后进行转化子的筛选。
1.2.2.3转化子的提取及验证
用灭菌过用于稻瘟病的牙签挑取大小约为2cm×2cm的菌块用于基因组粗提。利用CTAB提取基因组的方法获得转化子的基因组DNA。设计基因组的臂内引物，每个转化子基因组DNA为模板进行PCR扩增。利用野生型Guy11的基因组作为阳性对照，如果能够扩增出特异性目的条带的转化子，则为为敲掉失败或者是异位整合的转化子，对于不能够扩增出目的条带的转化子，再利用臂外引物进行进一步的PCR验证。如果可以扩增出1.5Kb的目的条带，就筛选到敲除突变体。