Western blot是半定量检测特异性蛋白的最常规方法。将47期蝌蚪进行视觉刺激培养,提取视顶盖蛋白。结合实验室的研究内容,针对一类组蛋白去乙酰化酶HDACs,选择合适的抗体进行Western blot检测。研究这些蛋白在视觉刺激后的含量变化,探讨视觉刺激过程中调控脑内视觉信息传递的分子机制,研究这些分子在视觉经验依赖过程中起什么作用,为后续实验提供理论依据。

2。1。1 非洲爪蟾介绍

从20世纪50年代以来,非洲爪蟾已经成为胚胎学、发育生物学、神经生物学、细胞生物学、功能基因组学等研究的重要模式生物。爪蟾作为一种经典的模式动物有如下优点:(1)作为一种脊椎动物,爪蟾比线虫和果蝇等更适合于用于人类疾病研究;(2)体外受精,排卵量很大,受精卵体外发育较快,器官发育过程可以直接观察;(3)卵较大,适合显微操作;(4)养殖成本非常低,注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)可以促进排卵受精,一年四季皆可,适合大量繁殖;(5)一些重要基因与人类之间有较高的同源性,为人类基因功能和疾病研究奠定了坚实的基础。

本实验是以非洲爪蟾(Xenopus Laevis)作为模式动物,成年非洲爪蟾购自美国NASCO公司,雌雄成年爪蟾饲养在去氯自来水的爪蟾养殖系统内,水温保持在22℃左右,12小时白天/12小时黑夜的周期光调控。每周喂1次猪心和1次合成饲料。爪蟾配对时,通过对成年非洲爪蟾腹腔注射人体绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, HCG ,雌蛙300IU,雄蛙150IU), 之后将其放置于水箱内产卵,最后选取受精卵放置于22ºC的培养箱,等到蝌蚪发育到47期进行下一步实验。文献综述

2。1。2 实验试剂

10XTBST缓冲液 

Tris(MW121。14) 30。3g(或25mL 1M Tris-Hcl pH 7。5) 

NaCl 80。0g 

KCl 2。0g 

加入ddH2O至1000mL(调pH至7。5),溶解后室温保存。

1XTBST缓冲液

10XTBST缓冲液 100mL

蒸馏水 900mL

Tween-20 1mL

由于比较粘稠,吸取前Tween-20将枪口减掉一块,吸取时应缓慢防止气泡产生,加入溶解后室温保存。

配制500mL的10xPBS pH7。4

NaCl 40g

KCl 1g

Na2HPO4 7。2g

KH2PO4 1。2g

溶于400mL的ddH2O中,调节pH至7。4,最后加ddH2O定容至500mL,过滤,室温保存。

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