2。1。3 实验仪器

HF151二氧化碳培养箱购自力康发展有限公司；AFZ-1001-U艾科浦超纯水系统购自上海百特科技有限公司；SIGMA低温高速离心机；超声波系统购自Biosafer公司；真空离心浓缩仪购自Eppendorf公司；双垂直电泳槽购自北京六一仪器厂；生物电泳图像分析系统购自上海复日科技有限公司；小胶电泳系统、转移电泳槽购自BioRad公司；质谱仪LTQ Velos、质谱仪Orbitrap-Elite、色谱 scientific EASY column购自Thermo公司；色谱Healthcare AKTA购自GE公司；离心机Centrifuge 5424R、恒温混匀仪、可见紫外分光光度计购自Eppendorf公司。

2。2 方法

2。2。1  CNE-2细胞培养

对CNE-2细胞进行连续传代培养（5~7），选用RPMI-1640培养基并加入10% 灭活胎牛血清、100 U/mL青链霉素、链霉素，置于细胞培养箱培养（条件参数37 ℃、饱和湿度及箱内含5% CO2），避免培养的细胞受到污染，若发现受污染应及时处理，每两日进行一次细胞换液。根据细胞生长状况进行传代（通常情况每两天传一次），细胞传代时注意要先用PBS洗涤细胞，再用0。25% 胰蛋白酶进行细胞消化1-2min，进行细胞操作实验时注意选取生长良好的细胞，一般为对数生长期的细胞。即当传代细胞贴壁生长到铺满培养容器底部80%左右，加入不同浓度的NO供体GSNO（每次临用前用RPMI-1640溶液稀释,0。22um过滤除菌)进行作用。文献综述

2。2。2  GSNO的合成与定量

按照文献[18]避光条件下配制GNSO ，400 mM酸化的GSH 0。4 mL（加入0。2 M HCL 0。2 mL），加入400 mM NaNO2 0。2 mL，混匀后室温反应15 min，用40% NaOH（约3-4 μL)，调节pH=7。2，避光保存于冰浴上。合成的GSNO用去离子水稀释200倍后测定在334 nm处的吸光度。所得的吸光度值与摩尔吸光系数0。767相比，然后乘以稀释倍数，即求得合成的GSNO的浓度。（用公式替）

c=200A/ε 

c表示合成的GSNO的浓度，吸光度用A表示，摩尔吸光系数ε=0。767