1。2 实验耗材及试剂

耗材：枪头；BF100-78-10型进口毛细管（购自美国Sutter Instrument公司）；EP管（购自江苏耀华玻璃仪器厂）。

试剂：PrimeScript®RT试剂盒（购自日本TaKaRa公司）；葡萄糖分析试剂盒、淀粉转葡萄糖苷酶、蒽酮（分析纯）、氢氧化钾、琼脂糖、海藻糖（购自Sigma公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（购自碧云天公司）；98%硫酸、PBS（购自上海生工生物有限公司）论文网

1。3 实验仪器

主要仪器：微量测定分光光度计（NanoDrop™ 2000型，购自美国Thermo Scientific公司）；光照培养箱（YC-D209型，购自中国亚都公司）；拉针仪（P-1000型，购自美国Sutter Instrument公司）；微量移液器（购自德国Eppendorf公司）解剖镜；（EZ4HD型，购自德国Leica公司）；电子分析天平（AL204型，购自中国上海梅特勒-托利多有限公司）；电动超微注射系统（IM-31型，购自日本NARISHIGE公司）；全自动灭菌锅（HVE50型，购自日本HIRAYAMA）；电热恒温水槽（DK-8D型，购自中国上海一恒科学仪器公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHC-9423A型，购自上海精宏实验设备有限公司）；台式高速离心机（Sorvall Primo R型，购自美国Thermo公司）；恒温培养箱（DNP-9272型，购自中国上海精密实验设备公司）；制冰机（购自GRANT XB型）； -80℃超低温冰箱（902-70-1型，购自美国Thermo Scientific公司）；超声破碎仪。

1。4 实验方法 

1。4。1 取材

（1）褐飞虱不同发育阶段海藻糖代谢变化

待养虫笼中刚出现四龄若虫时，进行取材。将此时所取褐飞虱标记为四龄的零点，之后再每隔12进行一次取材。每出现新的龄期时，该时间点即设置为该龄期的零点。每个时间点取褐飞虱21头，随机分装入3个洁净1。5 mL EP管内，直至成虫第60 h。将EP管进行标记，保存于-80℃冰箱待用。

（2）过量糖类物质对褐飞虱海藻糖代谢途径影响

首先制作琼脂糖平板。电子天平秤取琼脂糖0。5 g，微波加热溶于50 mL蒸馏水中。将琼脂糖凝胶倒入洁净塑料培养皿中冷却至室温后放置冰箱储存。

用毛细管拉针仪将玻璃毛细管拉到适合尺寸。各组分别用微量加样头吸取糖类注射剂（海藻糖600 μg/μL，葡萄糖500 μg/μL）及蒸馏水，打入毛细管中。注射前先用标准毛细管定量注射器每次泵出溶液的体积，并通过调整氮气压来调整体积使其符合注射量。

本研究选用的褐飞虱为5龄第一天的若虫作为注射的适宜龄期。显微注射仪参数调节为注射压强1000 pah，注射时间0。5 s，补偿压20 pah。用CO2将五龄褐飞虱若虫麻醉后放至琼脂糖平板上，使其腹面朝上，对胸部中足和后足间的外侧表皮处进行注射，注射体积为100 nL。注射后将其放至装有新鲜水稻的透明玻璃管中，纱布封口，放入人工气候培养箱中培养。24 h后存活褐飞虱为有效注射，于注射后48 h观察表型并取材。用于检测的褐飞虱数量为21只，每管7头，3管平行。文献综述

1。4。2 材料处理

往EP管内加入200 μL PBS超声破碎。再加入800 μL PBS，4℃下，1000 xg，离心20 min。取400 μL上清，4℃下，20800 xg，超离心60 min；剩余上清用于蛋白浓度、糖原浓度、海藻糖浓度测定。吸出超离心后的上清用于可溶性海藻糖酶（TRE1）和蛋白质（Pr1）的测定；沉淀用PBS洗两次并用PBS悬浮，该悬浮液用于膜结合蛋白海藻糖酶（TRE2）和蛋白浓度（Pr2）测定。