1。2 实验耗材及试剂

耗材:枪头;BF100-78-10型进口毛细管(购自美国Sutter Instrument公司);EP管(购自江苏耀华玻璃仪器厂)。

试剂:PrimeScript®RT试剂盒(购自日本TaKaRa公司);葡萄糖分析试剂盒、淀粉转葡萄糖苷酶、蒽酮(分析纯)、氢氧化钾、琼脂糖、海藻糖(购自Sigma公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天公司);98%硫酸、PBS(购自上海生工生物有限公司)论文网

1。3 实验仪器

主要仪器:微量测定分光光度计(NanoDrop™ 2000型,购自美国Thermo Scientific公司);光照培养箱(YC-D209型,购自中国亚都公司);拉针仪(P-1000型,购自美国Sutter Instrument公司);微量移液器(购自德国Eppendorf公司)解剖镜;(EZ4HD型,购自德国Leica公司);电子分析天平(AL204型,购自中国上海梅特勒-托利多有限公司);电动超微注射系统(IM-31型,购自日本NARISHIGE公司);全自动灭菌锅(HVE50型,购自日本HIRAYAMA);电热恒温水槽(DK-8D型,购自中国上海一恒科学仪器公司);电热恒温鼓风干燥箱(DHC-9423A型,购自上海精宏实验设备有限公司);台式高速离心机(Sorvall Primo R型,购自美国Thermo公司);恒温培养箱(DNP-9272型,购自中国上海精密实验设备公司);制冰机(购自GRANT XB型); -80℃超低温冰箱(902-70-1型,购自美国Thermo Scientific公司);超声破碎仪。

1。4 实验方法 

1。4。1 取材

(1)褐飞虱不同发育阶段海藻糖代谢变化

待养虫笼中刚出现四龄若虫时,进行取材。将此时所取褐飞虱标记为四龄的零点,之后再每隔12进行一次取材。每出现新的龄期时,该时间点即设置为该龄期的零点。每个时间点取褐飞虱21头,随机分装入3个洁净1。5 mL EP管内,直至成虫第60 h。将EP管进行标记,保存于-80℃冰箱待用。

(2)过量糖类物质对褐飞虱海藻糖代谢途径影响

首先制作琼脂糖平板。电子天平秤取琼脂糖0。5 g,微波加热溶于50 mL蒸馏水中。将琼脂糖凝胶倒入洁净塑料培养皿中冷却至室温后放置冰箱储存。

用毛细管拉针仪将玻璃毛细管拉到适合尺寸。各组分别用微量加样头吸取糖类注射剂(海藻糖600 μg/μL,葡萄糖500 μg/μL)及蒸馏水,打入毛细管中。注射前先用标准毛细管定量注射器每次泵出溶液的体积,并通过调整氮气压来调整体积使其符合注射量。

本研究选用的褐飞虱为5龄第一天的若虫作为注射的适宜龄期。显微注射仪参数调节为注射压强1000 pah,注射时间0。5 s,补偿压20 pah。用CO2将五龄褐飞虱若虫麻醉后放至琼脂糖平板上,使其腹面朝上,对胸部中足和后足间的外侧表皮处进行注射,注射体积为100 nL。注射后将其放至装有新鲜水稻的透明玻璃管中,纱布封口,放入人工气候培养箱中培养。24 h后存活褐飞虱为有效注射,于注射后48 h观察表型并取材。用于检测的褐飞虱数量为21只,每管7头,3管平行。文献综述

1。4。2 材料处理

往EP管内加入200 μL PBS超声破碎。再加入800 μL PBS,4℃下,1000 xg,离心20 min。取400 μL上清,4℃下,20800 xg,超离心60 min;剩余上清用于蛋白浓度、糖原浓度、海藻糖浓度测定。吸出超离心后的上清用于可溶性海藻糖酶(TRE1)和蛋白质(Pr1)的测定;沉淀用PBS洗两次并用PBS悬浮,该悬浮液用于膜结合蛋白海藻糖酶(TRE2)和蛋白浓度(Pr2)测定。

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