转录组是某一特定生理条件下，特定组织、细胞和器官所含有的全部转录产物的集合，是活跃表达基因的真实写照，转录组的这种特点尤其适用于研究有毒动物。蛇毒由细胞内编码功能蛋白的基因经转录、翻译和翻译后修饰等过程最终从毒腺中分泌出来[18,19]。基因组、转录组毒素转录本复杂多样的种类和结构必然引起蛇毒在蛋白组层面的多样性。可见，研究蛇毒腺转录组分对于研究蛇毒全蛋白组及明确蛇毒活性功能、新转录本的发现都是有积极意义的。无疑，蛇毒腺转录组高通量测序，使研究者能更为全面地阐述蛇毒进化适应意义，甚至在转录组水平发现大量在蛋白组水平无法检测到的具有潜在药用活性价值的蛇毒组分。

2。材料与方法

2。1。材料

孟加拉眼镜蛇（Naja kaouthia）两只购自广西百色；戊巴比妥钠；液氮；TRlzol(Life Technologies, USA)；THE RNA storage solution (Ambion, Inc。, USA)；Qubit 2。0光度计（Life Technologies，USA）；Nanouhotometer（Implen，USA）；Agilent 2100系统（Agilent Technologies，USA）；TruSeqT’’’RNA样品制备试剂盒（Illumina，USA）；AMlure XP系统（Beckman Coulter，USA）；Illumina HiSeqTM2500（Illumina，USA）文献综述

2。2。毒腺总RNA的提取

毒腺转录组测序用孟加拉眼镜蛇成体采自广西百色，共两个样本。动物带回实验室后常规饲养，期间提供足量饮水和食物。摘取毒腺前，将动物禁食两周并提毒，随后常规饲养，仅提供足量饮水；四天后，用戊巴比妥钠（s。c。30mg / kg）将两条蛇麻醉过量处死。随后从蛇头部两侧摘除毒腺，用无RNAase水冲洗彻底。将混合毒液转移至钵体，倒入液氮后迅速研磨，按照操作手册用TRlzol(Life Technologies, USA)提取来自每条蛇毒腺的总RNA。RNA熔化并溶解在100μl的THE RNA storage solution (Ambion, Inc。, USA)中。用1%的琼脂糖凝胶电泳评估RNA的降解和污染，并用Qubit 2。0光度计（Life Technologies，USA）和Nanouhotometer（Implen，USA）测量RNA纯度和浓度，并使用Agilent 2100系统（Agilent Technologies，USA）评价RNA完整性。从上述两个RNA样品中平均收集用于测序的RNA。

2。3。毒腺cDNA的合成与测序

根据制造商的说明书，用TruSeqT’’’RNA样品制备试剂盒（Illumina，USA）构建RNAseq文库。简言之，用寡核苷酸（dT）的磁珠纯化和富集mRNA。然后用片段缓冲液处理mRNA，并将它当做作模板，用逆转录酶和随机六聚体引物合成第一链cDNA，使用dNTI，DIVA聚合酶I和RNA酶H合成第二链cDNA。然后用AMlure XP系统（Beckman Coulter，USA）纯化双链cDNA，并进行末端端对过程，即poly (A) tail和测序适配器的连接。选择适配器连接的片段进行ICR扩增并使用AMlure XP系统（Beckman Coulter，USA）纯化以产生最终的cDNA文库。采用由中国北京诺维生物信息技术有限公司（www。novogene。cn）的Illumina HiSeqTM2500（Illumina，USA）平台进行深度测序。