耐重金属内生细菌的筛选及其吸附铅镉的特性(2)
植物体内存在丰富的植物内生菌，植物内生菌可以对植物的生长起促进作用。研究表明，在重金属环境中，接种内生菌同样可以明显增加植物的生物量：接种抗铅微杆菌和荧光假单胞菌后，在铅污染环境种植的油菜的生物量明显增加（Sheng XF et al. 2008）;接种能分泌ACC脱氨酶的芽孢杆菌后，在铅、锌、镉复合污染环境种植的景天的根长和株高均显著增加（Ma Y et al. 2015）。众多研究都表明，植物内生菌在提高宿主重金属耐受性方面有明显作用。植物内生菌一方面通过吸附重金属离子和分泌铁载体等代谢产物与重金属形成络合物等直接或间接的方式降低宿主植物内重金属抑制程度，另一方面通过促进植物的光合作用和增强植物的抗氧化系统等方式直接作用于植物表型，以提高宿主植物自身对重金属的耐受性（阮迪申 等 2016）。近年来，越来越多的研究者关注植物内生菌与植物联合修复重金属污染（陈苏 等 2017）。
南京栖霞山的铅锌矿已经开采优尔十余年，因此其周围环境如农田中的重金属污染问题也日渐严重，其中Cd和Pb均已超过土壤环境质量二级标准（储彬彬 2009）。本研究采用选择性培养基，从种植于南京栖霞山矿区土壤的两种大豆根内筛选重金属抗性细菌，并对筛选出的抗性菌株进行16S rDNA序列分析和种属鉴定，研究其遗传多样性。本研究可以为进一步探究细菌抗重金属机制提供基础，也可以为细菌作为重金属吸附剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 大豆品种
特早毛豆，简称为T；苏早一号，简称为S。种子购于江苏省农科院种子公司。
1.1.2 土壤
采集自南京栖霞山矿区周边农田土壤。
1.1.3 培养基和培养条件
（1）YMA （g/L）
甘露醇 10.0
K2HPO4 0.25
MgSO4•7H2O 0.20
NaCl 0.10
酵母粉 3.0
琼脂粉 20.0
pH 6.8-7.0
12l ℃高压灭菌20 min
（2）TY 液体培养基 （g/L）
胰蛋白胨 5.0
酵母粉 3.0
CaCl2•2H2O 0.7
pH 6.8-7.2
12l ℃高压灭菌20 min
（3）重金属溶液
CdSO4 18.55 g/L、Pb(NO3)2 159.86 g/L
（4）菌株培养条件
将供试菌株划线于YMA固体培养基30℃培养1 d或TY液体培养基30℃、180 rpm振荡培养16 h。
1.2 方法
1.2.1 大豆的栽植
将所采集的南京栖霞山矿区农田土壤晒干后分装于优尔个花盆内，三个花盆种植苏早一号，三个花盆种植特早毛豆，每个花盆内种植三株，种植一个月左右。当花盆内的大豆苗长出两到三片叶子时，去除两株，保留最旺盛的一株。待大豆苗长出七到八片叶子时，移出花盆，进行下一步实验。
1.2.2 大豆内生菌的分离纯化
取大豆一部分根部用自来水洗净，浸于无水乙醇中 4~6 min，用 0.1% 的 HgCl2消毒3~5 min，最后用无菌水清洗 6～8次。将消毒后的大豆根研磨，将匀浆涂布到 YMA 平板培养基中，30℃ 培养24 h。挑取YMA平板上形态合适的单菌落继续在YMA平板中划线纯化两到三次，然后将分离纯化后的单菌落接种于分别加不同浓度的Cd和Pb的 YMA 平板培养基中，并且将不添加重金属的YMA平板培养基设置为对照，30℃ 培养 4 d。Cd浓度设置为10、20、30 mg /L，Pb浓度设置为400、600、800 mg /L。将每个浓度重复三次，如果某个浓度下至少两块YMA平板中有菌生长，那么据此判断此菌株可以耐受此浓度的重金属。